请教酶消化法培养脐带间充质干细胞的问题

细胞干

我用的是0.1%二型胶原酶消化4小时，0.25%胰酶消化30min，但是细胞养几天就死了，请问是不是胰酶消化时间太长，过度消化所致啊？

yingjie

这个说不定的，根据你胰酶和胶原酶浓度和消化时间不应该是消化过度的问题，如果你的消化酶没什么问题的话，就查查你的培养基有没有问题，用的是DMEM/F12培养基吗?还有你培养基中加了些什么,一般10%FBS,双抗100单位/ml,谷氨酰胺1%,还有碳酸氢钠.也不知道你是怎么操作的,很难说,能说下你的做细胞过程吗

pailishi

我们是三种酶混合过夜消化呢，效果很好的

nek314

接种细胞有多少呢？换过液么？我觉得原代的时候细胞多一点比较好，首次换液培养时间长一些，换的时候半量或者1/3好一点。

赵贵芳

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/ E( Y6 V+ p0 N" M, k请问是哪三种酶啊？

细胞干

回复 yingjie 的帖子1 a! {7 P/ j% L  C. f+ z0 @, B
* N6 t. I/ z5 O1 {6 n( a+ z
我用的是GIBICO的DMEM培养基和FBS，也是加100U/ml双抗。; e  J, s. q1 V
我的做法是脐带拔胶后，盲剪剪碎，然后加0.1%二型胶原酶消化4h，这个时候组织比较松散了，然后再直接加0.25%胰酶消化30min，这个时候组织块已经很少了。终止消化，加PBS稀释10~20倍，过滤。% b( Y3 J/ B  T
消化液梯度离心（2500rpm 15min，1500rpm 15min，800rpm 10min）。9 \/ G/ w6 K3 w' B7 P, M
但是做下来，感觉得到的细胞不多，而且细胞基本都不贴壁，过几天都死了。% E* K, ]( s4 y6 {4 K# ~" @
请问你是怎么做的，结果怎么样？7 y4 ^) i0 N) c) d7 q# B

细胞干

回复 pailishi 的帖子: A. A) Z4 @& \

% \! v& Q& o; S9 `8 q6 ^6 k是那三种酶啊，消化时间多少啊？请问你消化得到的细胞多吗？几天贴壁？

yingjie

回复 细胞干 的帖子. U: I2 Y$ Q% m  E

* \  Z- L8 {$ n; e8 V9 g' ~. I 大部分都差不多，就是在消化上有点不同，这是我的做法
6 f! p5 H( H4 A- `2 u7 P( M$ P0 |8 I( I. f+ p% ^
Wharton胶组织用剪刀剪成1mm3的碎块于是先准备好的装有0.1%胶原酶的
. j' ]& l/ T: @7 s+ Y小烧杯中，置于37度恒温培养箱中消化4-6h, x' s8 [4 ]( w: E8 e
    加入适当体积的PBSA（PBS缓冲液中加入牛血清白蛋白，即BSA），一般是4 a2 ?$ N: _; p# q1 q( C
胶原酶溶液体积的2倍，250g离心5分钟。: P) }8 s9 x1 O0 {
    弃上清液，加入2.5%胰蛋白酶（大约是沉淀物体积的2倍），37度处理30) `. g/ z/ R8 R% _3 ^! X
分钟，轻轻摇动。  @$ Z! `0 {; x$ W5 ^) E
    加入适当体积的FBS（消化酶体积的10%）中止消化。
- D5 g6 F5 S/ R; k0 _; S) f- B9 M( ~    1200r/min离心5分钟,弃上清,用PBS清洗2次.0 c4 o7 e& \( _) k
    用培养液重悬分离得到的细胞,用滴管吸取细胞悬液于培养瓶中,摇匀.取少
/ A9 A: U- C4 G! R* n0 Z许于细胞计数板,生物显微镜下观察计数,加入培养液,调整细胞悬液浓度大约在; L0 T3 I0 s$ m4 l3 A+ |6 _+ p8 Y* c
1*10 6/ml.置于37度,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养./ o) ?! B( N  r- r
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     我想，你在消化上应该在胶原酶消化完了之后最好先终止消化离心，再加入胰酶消化，还有就是消化完组织后，要清洗细胞，这个很重要，把残留的胰酶清洗掉
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上官冰梦

回复 细胞干 的帖子4 `! |& H3 C7 ^& R
& K$ V4 Y* o' c$ R" X
为什么选择二型胶原酶啊？一型不行吗？我也是刚准备做这个用的是一型

细胞干

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/ @8 T& [+ L0 J  q: {& W' l! T请问yingjie：1.胶原酶消化、离心后，上清会不会分层啊，因为胶原比较粘稠，弃上清是把所有的上清都弃掉吗？会不会损失细胞啊？
, S8 P+ a( X! C0 A$ d. l8 e  u* F2.胰酶消化终止后不要过滤吗？还是先过滤再离心啊？