Western细胞裂解液的裂解效果与蛋白保存问题

runsong

我们做western使用的裂解液主要成分为20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，冰上将细胞吹散并裂解30分钟，之后12000转离心并弃上清，-20度保存。但此蛋白样品在保存过程中会有絮状物生成，严重影响蛋白浓度测定与使用。不知大家有没有遇到过此类情况，是何原因，如何解决？

YYQ6301

我们两种处理方法，一个是离心去沉淀，一个是煮好后保存

biotly

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7 A: p5 k3 G" V' s7 F) ]: N
5 \0 V2 L% Y1 s: E8 ]6 g这样子可以做出来吗？条带好不好看啊~~很期待

cjian6352

可以在保存前测浓度，然后加loading buffer煮了再保存，这样蛋白更稳定，不易降解，对后续实验也方便

sykbod

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! t4 g  q5 T+ J8 C  B0 p  x4 B( f1.       5 ug/ uL. Higher conc. leads to deposits.   |; g- }% f1 T5 P* I3 r* e
2.       Genome DNA looks like white flocculent deposits. But not your case I think.; K( X7 A/ Y6 f* H
3.       Depend on which pr you want to harvest. Membrane pr? ribonucleoprotein? ..." `: a3 B- P" X" w% W, F/ m
          generally, your lysis buffer should be good.3 O; j# s+ h. n3 G4 H! x2 x

zxcv12345

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3 T" y4 k3 W( s+ Z" x4 H1 b1.一般浓度一般低于5ug/ul，最多不会超过10ug/ul
6 U; c$ E, n$ r- w2。对不起，与DNA关系不清楚，但离心后大部分的DNA都沉下了，应影响不大
& i# i" R2 j, r9 A: E3.裂解液的问题应该不大

zzzhouzhong

我们实验室比较懒，做western直接PBS重悬细胞后加4*sds loading buffer煮，然后离心上样。做IP啥的才裂解，给你我们的配方。。NP40裂解液: 1M Tris8.0储液10ml，2M NaCl 15ml，NP40   2ml，dd水 173ml，配好后取50ml，加1片蛋白酶抑制剂PNSF，溶解后分装1200ul每管，-20保存。另外我们蛋白样品一般放-80，不过貌似跟这没有关系

runsong

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9 v# C' J# t+ ], S$ B- X% o% }
7 V5 A/ n; T9 E, A6 Z( }/ K" {$ H谢谢。还有几个问题。8 D3 j5 H2 K* F. ^# m
1、你们用的浓度大概多高啊，我一般是大约20微克每微升？0 B1 Y& [! c4 z) l+ d- }
2、形成沉淀与残留的DNA有无关系？# C8 q$ o5 g0 D. z- n$ ?7 P
3、我所用的裂解液有改进的必要吗？
# E2 L( I. F1 Z' K5 Q1 Q. ~, u

zxcv12345

回复 runsong 的帖子% V1 p0 R/ n8 j% |1 d
- G0 f1 S# t: \" E: H( r% y6 s
蛋白浓度高，或容易变性，可出现沉淀，有的为絮状。。解冻后，应离心，弃出沉淀然后测定蛋白浓度及使用。7 y4 t  D% ^* X9 K3 |. O

9 d- w! \" {( E6 ^5 D( W  J# S在冻存前，可降低浓度。
4 h2 i$ s; b+ h8 p( E如果不容易降解，可考虑4度保存

zxcv12345

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& l5 O# N, r# k9 Z5 B# x7 q
9 R/ K/ g2 `9 ?" ~蛋白浓度高，或容易变性，可出现沉淀，有的为絮状。。解冻后，应离心，弃出沉淀然后测定蛋白浓度及使用。8 ]7 a7 B6 l& m0 E; s. ~
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在冻存前，可降低浓度。. w' ]# P# N; k
如果不容易降解，可考虑4度保存