Western细胞裂解液的裂解效果与蛋白保存问题

runsong

我们做western使用的裂解液主要成分为20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，冰上将细胞吹散并裂解30分钟，之后12000转离心并弃上清，-20度保存。但此蛋白样品在保存过程中会有絮状物生成，严重影响蛋白浓度测定与使用。不知大家有没有遇到过此类情况，是何原因，如何解决？

YYQ6301

我们两种处理方法，一个是离心去沉淀，一个是煮好后保存

biotly

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( A9 d* Z; z0 W% a8 B$ I9 h6 R' d: M6 W7 \, x9 y
这样子可以做出来吗？条带好不好看啊~~很期待

cjian6352

可以在保存前测浓度，然后加loading buffer煮了再保存，这样蛋白更稳定，不易降解，对后续实验也方便

sykbod

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6 X  E6 t9 L0 Q5 f  o: g/ O& G5 i& X2 a
1.       5 ug/ uL. Higher conc. leads to deposits.
2 r, Z4 a1 R3 ^5 {5 C7 _# a$ q2.       Genome DNA looks like white flocculent deposits. But not your case I think.# b; X& Y  |' ]* e5 S
3.       Depend on which pr you want to harvest. Membrane pr? ribonucleoprotein? .... O" j3 x5 B2 `0 ?
          generally, your lysis buffer should be good.( H6 w/ K6 k3 k, ~% W. C

zxcv12345

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  Q, y. _8 b* Y( \! @! e2 j4 n+ E
1.一般浓度一般低于5ug/ul，最多不会超过10ug/ul
" v$ j# V9 I" u# W, j6 r0 _2。对不起，与DNA关系不清楚，但离心后大部分的DNA都沉下了，应影响不大
8 m; J# n7 l' \& Y3.裂解液的问题应该不大

zzzhouzhong

我们实验室比较懒，做western直接PBS重悬细胞后加4*sds loading buffer煮，然后离心上样。做IP啥的才裂解，给你我们的配方。。NP40裂解液: 1M Tris8.0储液10ml，2M NaCl 15ml，NP40   2ml，dd水 173ml，配好后取50ml，加1片蛋白酶抑制剂PNSF，溶解后分装1200ul每管，-20保存。另外我们蛋白样品一般放-80，不过貌似跟这没有关系

runsong

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) k$ P8 g. S: k1 M
3 u- Z. f. k! \* ?0 N* @7 ~5 c  Y谢谢。还有几个问题。5 G$ N; l. ^$ y  @3 T# s7 X( e
1、你们用的浓度大概多高啊，我一般是大约20微克每微升？  S" H* p; T8 L. V/ Q0 S" M: P) f% B
2、形成沉淀与残留的DNA有无关系？% b! F1 |( b% D
3、我所用的裂解液有改进的必要吗？
* |4 c. A* f0 y6 L

zxcv12345

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$ O9 h+ {. b2 q4 O7 |  N* S9 A  m) D# y7 v  H$ f/ V- `9 h! B
蛋白浓度高，或容易变性，可出现沉淀，有的为絮状。。解冻后，应离心，弃出沉淀然后测定蛋白浓度及使用。" N9 X  L% _/ p
4 a% E  E  @5 I2 }, M" x4 F) n4 n
在冻存前，可降低浓度。6 z; O; O2 J  I# x
如果不容易降解，可考虑4度保存

zxcv12345

回复 runsong 的帖子8 P& E. _* i) K% P, B/ ^& ^! O
3 {9 \: j# ]# s% ]) e
蛋白浓度高，或容易变性，可出现沉淀，有的为絮状。。解冻后，应离心，弃出沉淀然后测定蛋白浓度及使用。
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在冻存前，可降低浓度。( ?! @9 Q: j" ?" g8 J
如果不容易降解，可考虑4度保存