Western细胞裂解液的裂解效果与蛋白保存问题

runsong

我们做western使用的裂解液主要成分为20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，冰上将细胞吹散并裂解30分钟，之后12000转离心并弃上清，-20度保存。但此蛋白样品在保存过程中会有絮状物生成，严重影响蛋白浓度测定与使用。不知大家有没有遇到过此类情况，是何原因，如何解决？

YYQ6301

我们两种处理方法，一个是离心去沉淀，一个是煮好后保存

biotly

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% V- ]3 S0 B6 \- f8 {" _& a7 T& Y: ~- q: N. B( f5 ~$ ]
这样子可以做出来吗？条带好不好看啊~~很期待

cjian6352

可以在保存前测浓度，然后加loading buffer煮了再保存，这样蛋白更稳定，不易降解，对后续实验也方便

sykbod

回复 runsong 的帖子6 B# G8 |/ ~1 D/ v. l) N

* o) r8 o7 S0 I$ W1.       5 ug/ uL. Higher conc. leads to deposits. / o9 Q- ^' D% t# e' W; z: S; O( ]
2.       Genome DNA looks like white flocculent deposits. But not your case I think.
6 N* i0 {1 U3 r3 k( c' n) l3.       Depend on which pr you want to harvest. Membrane pr? ribonucleoprotein? ...
( `6 r/ j' `0 c- f3 q          generally, your lysis buffer should be good.
) D" u6 n; f4 R1 F1 U

zxcv12345

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: L1 o7 i6 l; _+ K, s' O# y8 s4 g4 b" K7 i9 k3 U
1.一般浓度一般低于5ug/ul，最多不会超过10ug/ul$ O3 g/ s+ V! g& \
2。对不起，与DNA关系不清楚，但离心后大部分的DNA都沉下了，应影响不大
% i& y0 D! d  `) k2 s% M& f3 ]3.裂解液的问题应该不大

zzzhouzhong

我们实验室比较懒，做western直接PBS重悬细胞后加4*sds loading buffer煮，然后离心上样。做IP啥的才裂解，给你我们的配方。。NP40裂解液: 1M Tris8.0储液10ml，2M NaCl 15ml，NP40   2ml，dd水 173ml，配好后取50ml，加1片蛋白酶抑制剂PNSF，溶解后分装1200ul每管，-20保存。另外我们蛋白样品一般放-80，不过貌似跟这没有关系

runsong

回复 zxcv12345 的帖子8 L6 R& v7 M6 \+ u0 T
; r% t0 C: M) N. a2 }
谢谢。还有几个问题。4 V7 e! ^: ]! w5 J9 D
1、你们用的浓度大概多高啊，我一般是大约20微克每微升？7 c# j, F( a9 U/ j8 ^7 h1 q2 Z5 [
2、形成沉淀与残留的DNA有无关系？
) n2 `! K' z. |. x/ d  Z* B. T3、我所用的裂解液有改进的必要吗？
: v; H& c: Q- p4 L! x

zxcv12345

回复 runsong 的帖子$ k; j; u5 E# q7 R

9 S2 R0 e' O$ J. K1 I蛋白浓度高，或容易变性，可出现沉淀，有的为絮状。。解冻后，应离心，弃出沉淀然后测定蛋白浓度及使用。
, u$ O1 i6 E9 l, _- O) C$ n& k. M" b! k+ T9 c$ w/ h$ t
在冻存前，可降低浓度。) m; _) Z" }1 Q) \) d: n" d
如果不容易降解，可考虑4度保存

zxcv12345

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! l: E- Q5 k6 d- n* T# W( f+ b& G9 n& E% w/ s
蛋白浓度高，或容易变性，可出现沉淀，有的为絮状。。解冻后，应离心，弃出沉淀然后测定蛋白浓度及使用。
: _$ G5 r; a, K, D! d. }$ ~8 N3 L( L7 |3 n# a+ e( M  Y$ Q  a
在冻存前，可降低浓度。/ q* Z& Z* [5 A
如果不容易降解，可考虑4度保存