Western细胞裂解液的裂解效果与蛋白保存问题

runsong

我们做western使用的裂解液主要成分为20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，冰上将细胞吹散并裂解30分钟，之后12000转离心并弃上清，-20度保存。但此蛋白样品在保存过程中会有絮状物生成，严重影响蛋白浓度测定与使用。不知大家有没有遇到过此类情况，是何原因，如何解决？

YYQ6301

我们两种处理方法，一个是离心去沉淀，一个是煮好后保存

biotly

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) d/ }9 }9 `' S1 O: X) g% T0 _9 [: y) K; G) b7 o
这样子可以做出来吗？条带好不好看啊~~很期待

cjian6352

可以在保存前测浓度，然后加loading buffer煮了再保存，这样蛋白更稳定，不易降解，对后续实验也方便

sykbod

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- _. f! n7 P# H+ I
: [6 d& w+ [2 H; R9 d  j7 s. W1.       5 ug/ uL. Higher conc. leads to deposits.
  S9 V$ ~& P/ q3 U% |( [2.       Genome DNA looks like white flocculent deposits. But not your case I think.
+ M  Z2 H: l/ Y' v7 \3 C3.       Depend on which pr you want to harvest. Membrane pr? ribonucleoprotein? .... k' M& _+ B0 C$ F  N! t, g
          generally, your lysis buffer should be good., L* a3 e5 }1 I2 @: ]: R3 c

zxcv12345

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( K- J" ~! \; C4 v; s- s; s- T1.一般浓度一般低于5ug/ul，最多不会超过10ug/ul
4 e# y1 k( p; i) E2。对不起，与DNA关系不清楚，但离心后大部分的DNA都沉下了，应影响不大6 E+ P9 i3 `4 r" F
3.裂解液的问题应该不大

zzzhouzhong

我们实验室比较懒，做western直接PBS重悬细胞后加4*sds loading buffer煮，然后离心上样。做IP啥的才裂解，给你我们的配方。。NP40裂解液: 1M Tris8.0储液10ml，2M NaCl 15ml，NP40   2ml，dd水 173ml，配好后取50ml，加1片蛋白酶抑制剂PNSF，溶解后分装1200ul每管，-20保存。另外我们蛋白样品一般放-80，不过貌似跟这没有关系

runsong

回复 zxcv12345 的帖子- f9 D- d- Q& n  w0 k+ ]

; M3 H8 T  h; [- v谢谢。还有几个问题。" ~) W2 Q+ L, s5 \* i" R
1、你们用的浓度大概多高啊，我一般是大约20微克每微升？; E; @8 l$ V, J9 q; U
2、形成沉淀与残留的DNA有无关系？/ D; \5 l9 {# _
3、我所用的裂解液有改进的必要吗？
1 d9 j2 o9 d' S$ r" v

zxcv12345

回复 runsong 的帖子. C- O3 z, i6 ?" T' D
) e1 c/ l2 w, t- q; U3 M: J. |( @* m
蛋白浓度高，或容易变性，可出现沉淀，有的为絮状。。解冻后，应离心，弃出沉淀然后测定蛋白浓度及使用。- s' {* X# C1 d
2 L3 e- M6 r' S
在冻存前，可降低浓度。
, m. @3 ]2 E' Q; b" v如果不容易降解，可考虑4度保存

zxcv12345

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% w$ d# P9 B( O, H  Z3 T蛋白浓度高，或容易变性，可出现沉淀，有的为絮状。。解冻后，应离心，弃出沉淀然后测定蛋白浓度及使用。1 ~0 }. R% x  w: J
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在冻存前，可降低浓度。+ ~  Q2 _2 r$ w
如果不容易降解，可考虑4度保存