PCR搞不定了，丢脸啊～请各位高人指教！

ying

这货叫做CAG promoter，俺是以质粒为模板P的，确定质粒是好的。序列如下：
  t: f1 f+ I) c. ~/ s9 D3 c3 _# wattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatgggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggcccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcgtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcgggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctgtaacccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtgcggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctggcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcgggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccatctccagcctcggggctgccgcagggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaa0 {( z; W- c; t3 C4 C. H* S) x/ G
引物：4 C/ O  r3 ?" @9 C2 C
F：attgattattgactagttattaatag( M) E( y2 \/ s+ j2 \7 e5 F% U
R：tttgccaaaatgatgagacagcac
0 q+ h; U1 j6 S6 |; B- k! i6 O1 sKOD-Plus的标准反应体系。56度和68度退火都试过。干干净净没任何带，只有前沿有个引物的影子。平行P的别的样品都是好的，说明体系本身东西都是好用的。* N' f5 R  v; q( m  \6 V
我强烈怀疑是由于CG太高导致的。虽然总体CG只有66%，但局部有些超过了90%。我对P高CG没有经验。据说是加DMSO，或者提高Mg，或者提高退火温度or解链时间，或者用一个叫slow down的特殊方法。总之“或者”太多而我的精力太少。鄙人这辈子做的克隆没有200个也有100多个了，没想到居然今天连个质粒上的序列都P不下来。暂时懒得摸条件了，借用宝地问问高手。
3 Z2 B& |. |6 @4 N- r2 r

leozarah

回复 ying 的帖子
( r) b: w5 a4 _
  n7 [) I/ G# V: A9 K9 G- m3 i楼主，你好，我最近也在P这个头疼的CAG启动子，都试了好几次了都没搞定，可以把你的引物和使用的酶，以及设定的具体参数发给我不（or 我邮箱：zh_liao@163.com）？？？感激不尽呀~~~拜谢!!!!

ying

订了个长引物，同时用KOD-plus和KOD-FX，结果只有KOD-FX得到了条带。估计一开始是因为引物太短，之后是因为KOD-Plus的体系仍然不能扩增这种高CG的序列。终于得到了。哎呀～疑似软广告了啊～

石山巨石

加betaine 试试 68度多跑几圈 (比如60)

ying

回复 sykbod 的帖子
5 ~4 W* `" x3 i0 c: k- n9 D8 Z! H4 [8 ~& @, |
引物已订。非常感谢您的热心帮助！

sykbod

回复 ying 的帖子/ S0 M( K3 n8 E* P& g

& R' L- A4 l* u% i  O. r- U% j  ]generally, if you have tried different annealing temperature and DMSO and it still not work. I prefer to design another pair of primer. You may want to use longer 5' primer.2 F9 b4 S, Y5 U2 ]6 [: V

/ V, {) ?1 ^7 B8 dGood luck.

ying

回复 hndxws 的帖子% N8 }+ _$ s+ I: _: |' w# Z
; N9 K' n( Z9 Z8 F. O
忽然想起了我当年的亲师父给我的Tm简单估计的软件（网页版），自从他毕业了我就自以为有经验了，就忘了他的宝典～今天算了算，果然只有41度多点儿啊～惭愧惭愧！被CG搞花了眼，搞错了主要矛盾啊～
4 A3 [# E3 s, V# z不过话说，有人用36度退火么～俺去试试～ 但估计也不行，这回就该CG捣乱了～不管了，试试再向大家汇报，当然，引物先订出去～

ying

回复 sj03572001 的帖子, R8 _( C7 Q# \

7 N- u1 x* T( f5 K% b; L; G( ~6 U此酶我们实验室还真有，可惜找遍冰箱，酶确实找到了，还不少，就是没有buffer。汗～

ying

回复 hndxws 的帖子
/ H7 K0 j8 a7 m( P" V; r6 O! {' v. ?+ y% P0 c9 r
多谢这位大神，至少现在我自己看来，可能此大神的话真的是对的。鄙人教训果然长了不少我摸了DMSO梯度，退火温度梯度，Mg梯度，还换了个invitrogen的高CG酶，果然都不行。条带我就不献丑了。我马上订引物，做完再向大家汇报！

sj03572001

建议用TAKARA 的PrimeSTAR® HS DNA Polymerase with GC Buffer，货号：：DR044A，我去年扩一个基因遇到高GC的情况，普通的TAQ酶总是跳过高GC区（高GC区可以形成复杂的二级结构），或者在高GC区延伸终止，后来用TAKARA的这个酶，一次就搞定了