PCR搞不定了，丢脸啊～请各位高人指教！

ying

这货叫做CAG promoter，俺是以质粒为模板P的，确定质粒是好的。序列如下：$ O3 F7 H0 Z5 D5 F
attgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatgggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggcccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcgtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcgggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctgtaacccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtgcggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctggcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcgggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccatctccagcctcggggctgccgcagggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaa, u, l0 y3 g4 m) |2 J3 ?( Z/ d
引物：
$ ?5 d( M4 i( v  p2 b6 u% OF：attgattattgactagttattaatag
; i8 ?: [4 m( S# P9 nR：tttgccaaaatgatgagacagcac* `% U1 [/ M) K) g1 G! d
KOD-Plus的标准反应体系。56度和68度退火都试过。干干净净没任何带，只有前沿有个引物的影子。平行P的别的样品都是好的，说明体系本身东西都是好用的。
' g8 Y( ?6 R# O7 y! ~; y我强烈怀疑是由于CG太高导致的。虽然总体CG只有66%，但局部有些超过了90%。我对P高CG没有经验。据说是加DMSO，或者提高Mg，或者提高退火温度or解链时间，或者用一个叫slow down的特殊方法。总之“或者”太多而我的精力太少。鄙人这辈子做的克隆没有200个也有100多个了，没想到居然今天连个质粒上的序列都P不下来。暂时懒得摸条件了，借用宝地问问高手。
0 u1 S( v7 w) k

ying

我是从质粒P，不是从基因组。要克隆到另一个载体上的。位置都定好了不能换的，引物只能这样，引物就是最两端的序列。没法换引物，只能改变其长度。我的引物其CG比例都正常的。

ying

回复 hndxws 的帖子: g# C& [( E! n2 W! c
# D6 X9 H/ d% I; v4 J
非常感谢！另外感谢楼上诸位！我想我先按照楼上试试，搞不定再换引物吧～毕竟订引物比较麻烦，手边能作的努力先试试。

ying

回复 hndxws 的帖子5 N. f( i0 d& N$ Z( }: X6 y& c* m
: O' o$ {% y+ l/ M" {0 q
多谢这位大神，至少现在我自己看来，可能此大神的话真的是对的。鄙人教训果然长了不少我摸了DMSO梯度，退火温度梯度，Mg梯度，还换了个invitrogen的高CG酶，果然都不行。条带我就不献丑了。我马上订引物，做完再向大家汇报！

ying

回复 sj03572001 的帖子) [. Q1 D) Q  J' p! S: p
/ j% q0 e2 \# W- S5 d
此酶我们实验室还真有，可惜找遍冰箱，酶确实找到了，还不少，就是没有buffer。汗～

ying

回复 hndxws 的帖子
" t! t; P( a  ^! z' l
3 H  [$ k& n2 P$ F) {- t  p忽然想起了我当年的亲师父给我的Tm简单估计的软件（网页版），自从他毕业了我就自以为有经验了，就忘了他的宝典～今天算了算，果然只有41度多点儿啊～惭愧惭愧！被CG搞花了眼，搞错了主要矛盾啊～& E3 M" j+ N# _& c: l/ O# b" @
不过话说，有人用36度退火么～俺去试试～ 但估计也不行，这回就该CG捣乱了～不管了，试试再向大家汇报，当然，引物先订出去～

ying

回复 sykbod 的帖子
2 B1 l+ L1 m" o' J9 ~
. S( A- Z4 H, K5 x. ]( b& H( G+ l引物已订。非常感谢您的热心帮助！

ying

订了个长引物，同时用KOD-plus和KOD-FX，结果只有KOD-FX得到了条带。估计一开始是因为引物太短，之后是因为KOD-Plus的体系仍然不能扩增这种高CG的序列。终于得到了。哎呀～疑似软广告了啊～