脂肪干细胞的提取问题

dxldeyou_2006

哪位高手知道提取脂肪干细胞的提取都需要哪些试剂啊？本人想做一次脂肪干，了解到一些试剂，胶原酶1是必须的吧?红细胞裂解缓冲液有需要吗？是不是用来终止酶的？

相宜

I型胶原酶，双抗，pbs，胰酶 EDTA  FBS，至于红细胞裂解液个人觉得不用也行，但是还要看自己呀

相宜

DMEM培养基，有的说用高糖，低糖和F12 这个楼主在多查查文献 选择下自己合适的吧

dxldeyou_2006

回复 相宜 的帖子
( E/ _, M% X' k# j- M# V6 m# h5 k
- o. `6 z: A0 b5 m+ ^请问EDTA是用来终止胶原酶的吗？要什么浓度？

dxldeyou_2006

回复 相宜 的帖子$ [! i8 _* ?4 V  U  a# A5 T, d
; m/ \. D6 d$ U# h4 r: j/ B- |
高糖低糖的培养基是干什么的哦？我在文献上都没看见过啊！

Demon_CN

1用抽脂机抽取脂肪，建议将脂肪颗粒打碎
9 F7 N  q% n: g" c2用 I型胶原酶37℃恒温摇床消化 1h，期间需反复震荡混匀（最好用振荡摇床）。/ T7 x2 D2 H  H
3 等量体积的完全培养基(高糖DMEM+l0%胎牛血清+l%双抗)中止消化。
! ~, A" c! U- n0 I' m! D4 消化后的匀浆用200微米的滤网过滤，去除块状脂肪组织和结缔。0 W7 e) ?; c; v  K2 |
5 1000转离心10min（成熟脂肪细胞在表层油滴下方、培养基上方，而处于离心管底部的是脂肪干、还有其他细胞）
! J+ A7 D0 d# n+ S6 b) ?离心后去除上层油滴，将漂浮的脂肪细胞转移至新的离心管中，加入PBS清洗，1000r10min离心。重复此过程数次。（进一步纯化）
, o1 e$ H7 R" z8 w! i/ P1 p4 x  L: I将清洗干净的脂肪细胞用完全培养基重悬，计数。/ F* }$ Y3 o' F) z  l) g
6接种 按10000个cell/m23 Y: r2 o( C. j  _3 ?6 f2 I
, F- Y6 x8 S" P2 \/ t

& l2 D: @% x1 Y7 pEDTA是用来辅助胰酶消化的不是用来终止的，终止消化用含蛋白量大的比如胰酶。0 [& q* t8 S- |, z, b# L5 E
EDTA用来螯合二价离子，二价离子的存在会抑制胰酶活性
8 {- w7 |' Y6 Z7 B& j7 u
8 G. i' Y! h7 _) j4 A6 _DMEM用低糖的，高糖会促进分化。
* @, w9 s2 M: t7 g. g! ~3 c! D高低糖的区别就是基础培养基含糖的不一样（低糖DMEM与葡萄糖为1100毫克/升，高糖DMEM为4500毫克每升，。）

owenlion

楼上的朋友们说的都可以，根据我的经验，IV型胶原酶也可以，消化时间也可以延长点。另外可以直接培养脂肪组织，也可以长出贴壁的MSC

荷荷

1.拿到脂肪组织后用生理盐水或者PBS洗至无血色，离心，弃上层液体；
& ]5 S7 ^( b1 x2.加入适量I型胶原酶，摇床220rpm 30分钟，观察脂肪组织成糜状即可；
' _/ q2 U$ x- z$ u3.加入等量完全培养基（低糖DMEM+l0%胎牛血清+l%双抗）终止消化；/ d! n% ?9 t. S# x% }) e
4.离心或静止片刻，去除上层油脂，100微米滤器过滤；1 J- [& r# ]/ `# w' K5 K' o8 X4 A
5.1200rpm 8min，弃上清，加入pbs重悬，1200rpm 8min；, a- X& k$ e  @/ }
6.弃上清，计数，1200rpm 8min；
5 ^2 P2 U% O9 p) \6 r$ W7.接种 细胞密度10的6次方/毫升。: k/ B6 ~# _2 U% e

- x% \# a6 \6 I, h- o注意：pbs清洗过程中尽可能的去除油滴；第5步离心后根据个人习惯选择是否红细胞裂解；

相宜

回复 dxldeyou_2006 的帖子
1 d+ f: Q+ |# l+ R$ P0 R6 c5 x3 V% H4 p" b$ {. O% |3 T; m5 H- C8 O
是一种螯合剂，一般你买的胰酶里面有含EDTA的，你可以先把EDTA的基础知识复习一下

相宜

回复 荷荷 的帖子6 B4 {2 E  d1 v7 J9 R

# J$ w: w7 O  {学习了