多段连的克隆

ying

本人做一个比较复杂的克隆，设计如下策略：

ying

请教一下各位，可以这样子做吗？ 因为四个要插入的片段大小都在1.2K左右，合起来有4.8K，如果用PCR来搭桥，需要搭很多次，不想这样做，怕突变。所以就打算分别P出各个片段，然后回收以后再酶切，切出粘性末端，然后用T4连接酶来接上。因为考虑到效率不会很高，所以再进行一轮PCR扩增（用两端的引物），再酶切插入载体。这样相当于每个位置过了2次PCR，总轮数在60圈以下。（KOD-plus II）
9 P! Z: R! T+ @, _& a不知各位有什么见解，这样做合理与否？

ying

图里面有个词拼错了，是用"CR using Ligation products as template",不是"produce".抱歉

LQAI2012

首先，不太明白的是，你说的“PCR来搭桥”是什么意思？
+ x9 H5 t5 V$ w8 B+ T+ \" A% @( Y4 t6 k# A: M  w
然后，最近我也做了一个与你相似的工作，是将三个外源片段连接到一个载体上。你上述所说的也是我在做的过程中的一种方案。
/ y+ o! k" F& z  P) P很明显，这个方案在理论上是完全木有问题的。由于多片段的连接在一步步的产物酶切、纯化过程中的损失和多次连接的低效率，给这样的工作带来不小的麻烦。理论上只要有一分子的四片段连接存在，用PCR扩增就能得到大量的四片段，然后连接到目的载体上。* g6 @2 z, o/ s+ @, z0 |8 q
然后，要做PCR，至少得保证那个一分子的四片段的存在！！也就是说，在各个内切酶的双酶切时都能切开！然后都能连接起来，得到少量的四片段。: D' N* F/ D* F" Z6 e- `6 h  C
其次，PCR扩增的时候，可能引物不能将就原来的片段1正向和片段4的反向了。因为你之前设计引物的时候应该没有考虑这四片段的总序列。这样即两个引物的Tm可以将就，中途出先错配的几率也是很大的。
# I8 N9 L2 D( R2 d( l其次，PCR长片段Tap酶的选择，应该注意。既要考虑到长片段的扩增能力，也要照顾你提到的保真性的问题。
7 G& R2 W- N3 r" ]
& b  G0 o8 y( n! o" u. ~' l- E还有，你是觉得这个方案能够减少序列中碱基突变的可能吗？但像这样的话每个片段也是经过了两次PCR，而且在最后一次4.8Kb的扩增中突变几率也该相对变大，除了在材料如保真酶等的选择上下点功夫，这个方案本身肿么会减少突变的几率？
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期待交流

ying

回复 LQAI2012 的帖子6 W6 K+ L# l2 N: l9 B
  X' E* h2 |5 ~1 d, A

+ B$ ^! P6 `! l5 C9 \% d1 o! s) N8 o6 R; z6 p( w; l6 ~
我指的搭桥是overlap PCR。
: R# l( J9 B1 z0 s  ~2 x我也觉得理论上没有问题的说～' n4 s0 y" \* ?
关键看“实践上”怎么样咧～' J0 v2 ?  c9 m9 `9 ^
我觉得似乎应该在“四段连”的时候把两端的两个片段少加点，中间的片段多加点，连接的时候都浓度高点，4度过夜，然后最后PCR的时候template少加点。觉得这样会不会容易些～; s+ h( [) ]8 u8 h" K; C# [

0 F1 D# ^% N$ r4 r多谢指导 ：）

zxcv12345

回复 ying 的帖子8 B# Y" B( O0 y8 a; @% N; c

( i$ P! |& i; `  q' `做的太复杂了。
- v7 k  a, B) N0 C$ E8 q& p% k: b. B  X1 s+ l; J: X  B
可以两次PCR搞定的
! g' `! O. v4 G* N设计引物时，要在A\B，B\C和C\D之间有重合，然后分别PCR，回收各自片段。
7 B: i  D' B3 J9 j5 g& z9 V然后模板用A\B\C\D等量，引物为A 5末端和D 3末端，直接PCR。
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如果A\B\C\D为不同基因的片段，可考虑一步PCR搞定。用所有重合的引物，及模板PCR。

LQAI2012

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说不上指导啦……; S0 D7 w* q, `0 X* |! l& F
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老实说，虽然这个方案理论上木有问题，也作为主行方案之一。但由于当时用的Taq酶没有扩增出我的“三片段”，所以实验结果并不是按照这个方案做出来的。而是最直接的，先连接三片段，再加入载体连接，然后转化，居然得到了重组子……之后换了Taq后，也扩增出了“三片段”，但那时已经到重组子筛选了，就没有顺着这个方案再继续做了。
# d. m" N# w: U8 y7 @当然，你要连接四个片段，难度肯定大多了。但依然建议在你在做这个方案的同时，可以将那个最直接的最笨的“连接、连接、转化”的方案同时进行，当然，成功的几率很小，要是仔细算还有点浪费材料。但那个方案是比较省时间的，要是能运气好直接就做出来，就不用一步一步PCR纯化、酶切、纯化、连接……* R& |6 Z8 h1 u$ H4 I) @$ f% O! S
还有，要是直接将4个片段连接，不容易得到“四片段”的话，可以试着先得到“两片段”或“三片段”% p& x2 N/ v8 `6 T& m9 C5 {2 `7 ~
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祝实验早日成功~！