核型分析求助

huangcong1988

昨天做了一次核型分析，基本步骤是：
, ^1 ~/ A( O& `' B4 T# O1.秋水仙素，终浓度0.1μg每ml，处理4个小时
1 ^( D+ T  I& Q' o" V2.吹起细胞，离心，弃上清
' Q. F1 ^  k9 F' |/ ~# Y3.加入5ml 0.075M的氯化钾，37°，20min
3 h' s& a- }6 a5 [! @$ a9 {7 Q4.加固定液1ml，离心，弃上清: s/ Q! u) y6 U5 r
5.再加固定液5ml，静置20min，离心，弃上清
+ e, w! k4 U+ j3 z# H) M1 S3 Y6.重复步骤51 ]- o7 p' u% \, X1 D
7.再加固定液1ml，将细胞悬浮! e3 b% g, P, @8 c) I8 S
8。从﹣20取出预冷载玻片，于20cm高度滴两滴细胞悬液在玻片上，过火数次，干燥
7 {6 B& P# K9 P7 a. o- s( i: H+ X9.giemsa染色，10min
. L+ _( p! ^  @6 g10.二甲苯浸载玻片，晾干
/ [$ M! V5 N8 C  I) p  Q11，镜检
; r& v& b! {* b* y8 X
$ J- g5 f  K/ i. z9 R: o几个问题：* B# m& ?4 N. v6 z- v
1.第七步的细胞悬液要在﹣20里面保存备用吗？会结冰么？结冰怎么融？常温或者四度放置不行么？能放多久2 Q# w) ]( A% g3 G* L
2.二甲苯浸漂的作用是什么？二甲苯什么功能？. F6 p) r, }4 |# |
3.制好的片子能不能直接显微镜 看，有的人说需要静置老化处理
+ W' ?% F: {& [4 G* C. i4.40×的为什么不能看清，我看了一下，看不出效果，一定要100倍油镜么？

myrudy

4度是可以存放，-20度是不会结冰。

ontheway_hit

1.第七步的细胞悬液室温就可以，为什么要放在﹣20呢。我做的时候就是室温。资料里也没有说要低温的。
2 z( Z8 r* V3 l1 E5 W2.二甲苯是使细胞透明度提高，具体我也不清楚。
. [/ ~8 u( b" j2 A8 j3.可以直接看/ h1 e1 B7 x" [$ f/ F
4.100倍油镜效果好。

YYQ6301

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& [8 X* n  m# k" r+ o
! U1 y6 ]$ m6 u0 a" I7 T6 a! l1、固定好的细胞可以放在4°C长期保存，没有必要放在-20°C+ N# r7 l0 L7 k8 ?4 B9 J% [
2、二甲苯浸泡可以增加细胞的透明度$ ~4 n0 w+ o9 @  A$ s
3、片子是可以直接看的，老化是为了显带. X% H; Y1 W% K: `" R5 R( {% l% U+ d$ i: ]
4、100倍的油镜可以观察清晰

huangcong1988

回复 YYQ6301 的帖子: }. @# K+ p6 I1 K1 P, c" B1 ^
+ p  L/ P4 V& J4 Q* q8 T
用秋水仙素处理细胞四个小时以后，是用胰酶消化后离心获取细胞好呢，还是直接吹起细胞好呢？胰酶处理不行吗？感觉要吹起细胞很难啊，细胞贴壁很好，很难吹打下来，还有就是除了第一次离心，之后离心都看不到沉淀，正常吗？师兄说是整个过程可以一直看到沉淀的，我就第一次能看到沉淀，但是加了低渗溶液之后的所有过程都看不到沉淀，问题出在哪呢？

huangcong1988

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用秋水仙素处理细胞四个小时以后，是用胰酶消化后离心获取细胞好呢，还是直接吹起细胞好呢？胰酶处理不行吗？感觉要吹起细胞很难啊，细胞贴壁很好，很难吹打下来，还有就是除了第一次离心，之后离心都看不到沉淀，正常吗？师兄说是整个过程可以一直看到沉淀的，我就第一次能看到沉淀，但是加了低渗溶液之后的所有过程都看不到沉淀，问题出在哪呢？

YYQ6301

我们都是胰酶消化后离心，整个过程离心都能看到沉淀的，你的会不会是低渗作用时间太长了呢

huangcong1988

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' A/ e$ `4 Y  P* h' Y* @" \# J* w6 k) i  Z
还有一个问题就是：你们一般怎么配秋水仙素的？因为我买的是1g的，所以先加入50mlPBS，然后再稀释10000倍（具体就是10倍10倍稀释），然后吸取400μl加到7.6ml的新鲜培养基中，直接用，这样行吗？总感觉不能混匀啊，就是秋水仙素量是不是少了点呢？终浓度0.1μg每ml是不是这样配的呢？第一次做，望指教

huangcong1988

回复 YYQ6301 的帖子! C7 R1 k3 `/ X# H6 L0 g$ U- n

0 @( t7 h3 d/ T6 [  |! Q" P: M" m4 o还有一个问题就是：你们一般怎么配秋水仙素的？因为我买的是1g的，所以先加入50mlPBS，然后再稀释10000倍（具体就是10倍10倍稀释），然后吸取400μl加到7.6ml的新鲜培养基中，直接用，这样行吗？总感觉不能混匀啊，就是秋水仙素量是不是少了点呢？终浓度0.1μg每ml是不是这样配的呢？第一次做，望指教

ontheway_hit

回复 huangcong1988 的帖子  z2 X5 H3 `2 L
7 F; u2 E# s! E1 t
称取10mg秋水仙素，溶解于100ml生理盐水中，即为100μlg/ml，过滤除菌，分装到1.5mlEP管，-20度保存。一般的介绍里就是这么配的。你一次把1g秋水仙素都用了，是不是太浪费了？估计没人会这么配的。