核型分析求助

huangcong1988

昨天做了一次核型分析，基本步骤是：5 x( R7 ^, {' j5 V2 H) f: v9 J6 P. l
1.秋水仙素，终浓度0.1μg每ml，处理4个小时. _; X# p# F2 e9 f) N4 E" }
2.吹起细胞，离心，弃上清( r) K1 C0 a; ]  ^( A$ D% J) n, S
3.加入5ml 0.075M的氯化钾，37°，20min
1 P8 W% U; T* [- T$ J4.加固定液1ml，离心，弃上清
+ y# K7 \+ ^6 V, W5.再加固定液5ml，静置20min，离心，弃上清8 |, R! G  j% m8 H; e
6.重复步骤5
4 x. `5 H) p  ], G7.再加固定液1ml，将细胞悬浮
( h6 g7 ?. D$ b" V8。从﹣20取出预冷载玻片，于20cm高度滴两滴细胞悬液在玻片上，过火数次，干燥/ H7 k: U5 g6 C( y% K& v9 M: q$ \% F
9.giemsa染色，10min4 Z3 D! d7 s' E0 W) {+ H
10.二甲苯浸载玻片，晾干
6 H! j0 T# M9 l8 W/ h' h9 h# l! h11，镜检# v! m6 E1 C; e3 k
+ _+ b! M4 {5 m/ }2 R( w0 v& N: Q
几个问题：8 ~/ M% V3 S, v. |, d2 \( p
1.第七步的细胞悬液要在﹣20里面保存备用吗？会结冰么？结冰怎么融？常温或者四度放置不行么？能放多久
# c% v5 |1 c" ]6 y; e* x2.二甲苯浸漂的作用是什么？二甲苯什么功能？- f- g" G+ p- w7 ]* Z9 r" Z
3.制好的片子能不能直接显微镜 看，有的人说需要静置老化处理4 K! S: F9 e; D7 b2 s
4.40×的为什么不能看清，我看了一下，看不出效果，一定要100倍油镜么？

myrudy

4度是可以存放，-20度是不会结冰。

ontheway_hit

1.第七步的细胞悬液室温就可以，为什么要放在﹣20呢。我做的时候就是室温。资料里也没有说要低温的。, |! c9 G( X5 f# Z- K6 p. w' Z
2.二甲苯是使细胞透明度提高，具体我也不清楚。
' j% j) a/ ~+ M3 F; {3.可以直接看
+ M, g6 s! m% w/ N3 z' [5 M4.100倍油镜效果好。

YYQ6301

回复 huangcong1988 的帖子7 T( K) X9 D9 o5 t$ }" k

7 R* ~% h' R8 d% ?0 h1、固定好的细胞可以放在4°C长期保存，没有必要放在-20°C% O- B& e4 B; X! O% u" B3 _2 u
2、二甲苯浸泡可以增加细胞的透明度& f+ V3 y) F( Y9 W  [
3、片子是可以直接看的，老化是为了显带
4 T6 ?8 f5 O0 f* y( _4、100倍的油镜可以观察清晰

huangcong1988

回复 YYQ6301 的帖子
) I8 Q6 F4 R7 l; a! I$ E* A
- x0 J# n# N3 t6 C用秋水仙素处理细胞四个小时以后，是用胰酶消化后离心获取细胞好呢，还是直接吹起细胞好呢？胰酶处理不行吗？感觉要吹起细胞很难啊，细胞贴壁很好，很难吹打下来，还有就是除了第一次离心，之后离心都看不到沉淀，正常吗？师兄说是整个过程可以一直看到沉淀的，我就第一次能看到沉淀，但是加了低渗溶液之后的所有过程都看不到沉淀，问题出在哪呢？

huangcong1988

回复 ontheway_hit 的帖子* P/ X3 w. r/ }. V0 r' n
! P( ^' k( Z4 T. M4 {
用秋水仙素处理细胞四个小时以后，是用胰酶消化后离心获取细胞好呢，还是直接吹起细胞好呢？胰酶处理不行吗？感觉要吹起细胞很难啊，细胞贴壁很好，很难吹打下来，还有就是除了第一次离心，之后离心都看不到沉淀，正常吗？师兄说是整个过程可以一直看到沉淀的，我就第一次能看到沉淀，但是加了低渗溶液之后的所有过程都看不到沉淀，问题出在哪呢？

YYQ6301

我们都是胰酶消化后离心，整个过程离心都能看到沉淀的，你的会不会是低渗作用时间太长了呢

huangcong1988

回复 ontheway_hit 的帖子) `8 R1 L2 t% z& Y8 I. y/ ~
5 _( t+ V2 V5 i% D5 u+ a% z6 \
还有一个问题就是：你们一般怎么配秋水仙素的？因为我买的是1g的，所以先加入50mlPBS，然后再稀释10000倍（具体就是10倍10倍稀释），然后吸取400μl加到7.6ml的新鲜培养基中，直接用，这样行吗？总感觉不能混匀啊，就是秋水仙素量是不是少了点呢？终浓度0.1μg每ml是不是这样配的呢？第一次做，望指教

huangcong1988

回复 YYQ6301 的帖子' x; S' t* @; @( E
4 `0 B2 `% r+ r1 w$ [
还有一个问题就是：你们一般怎么配秋水仙素的？因为我买的是1g的，所以先加入50mlPBS，然后再稀释10000倍（具体就是10倍10倍稀释），然后吸取400μl加到7.6ml的新鲜培养基中，直接用，这样行吗？总感觉不能混匀啊，就是秋水仙素量是不是少了点呢？终浓度0.1μg每ml是不是这样配的呢？第一次做，望指教

ontheway_hit

回复 huangcong1988 的帖子( B- ]5 q0 X% K: a

5 n4 H0 q- L0 ^8 r8 C3 I称取10mg秋水仙素，溶解于100ml生理盐水中，即为100μlg/ml，过滤除菌，分装到1.5mlEP管，-20度保存。一般的介绍里就是这么配的。你一次把1g秋水仙素都用了，是不是太浪费了？估计没人会这么配的。