核型分析求助

huangcong1988

昨天做了一次核型分析，基本步骤是：6 @2 I+ ^- W. [- y
1.秋水仙素，终浓度0.1μg每ml，处理4个小时
* c+ K" o, {( p6 ?3 t2.吹起细胞，离心，弃上清3 C( \  t2 o( G  w
3.加入5ml 0.075M的氯化钾，37°，20min
: q4 c' o' m% E  P; M, S4.加固定液1ml，离心，弃上清
9 f9 |6 R  m6 ]* n5.再加固定液5ml，静置20min，离心，弃上清
3 F, m# Y) M/ \# p6.重复步骤51 n1 o5 ]* ?2 n, [: f: n1 v) x5 i! m* @
7.再加固定液1ml，将细胞悬浮! n1 ]2 j3 o+ q+ i$ L
8。从﹣20取出预冷载玻片，于20cm高度滴两滴细胞悬液在玻片上，过火数次，干燥
7 }" }+ X& x% W' L3 m$ a: _" W9.giemsa染色，10min9 G' Y0 _; j# Y! `5 d* b
10.二甲苯浸载玻片，晾干) d% V  S1 O" F0 W" z, z9 N
11，镜检
' r$ ?5 u$ S9 F6 Q$ }; X
4 {! s  Z* I% c( U几个问题：
: c* l# }& ?1 F7 D: v" x1.第七步的细胞悬液要在﹣20里面保存备用吗？会结冰么？结冰怎么融？常温或者四度放置不行么？能放多久
0 h. M5 G" y7 `% i% ^; m2.二甲苯浸漂的作用是什么？二甲苯什么功能？
3 h/ H( A; h* a+ J% S( P& e3.制好的片子能不能直接显微镜 看，有的人说需要静置老化处理: n/ F# y$ _4 Q: B4 X
4.40×的为什么不能看清，我看了一下，看不出效果，一定要100倍油镜么？

myrudy

4度是可以存放，-20度是不会结冰。

ontheway_hit

1.第七步的细胞悬液室温就可以，为什么要放在﹣20呢。我做的时候就是室温。资料里也没有说要低温的。
" C! @' T, [4 M/ C* _( s2.二甲苯是使细胞透明度提高，具体我也不清楚。
; i: p' H, _; o7 T+ I0 c4 l3.可以直接看9 [# e! ]9 |& d) Q, }- S
4.100倍油镜效果好。

YYQ6301

回复 huangcong1988 的帖子
; H* Z6 r& ~$ u  l) J  W3 h4 U- N- \$ t+ @
1、固定好的细胞可以放在4°C长期保存，没有必要放在-20°C
3 N8 K" F5 N* ~2、二甲苯浸泡可以增加细胞的透明度
# s. P& z7 I4 m) s3、片子是可以直接看的，老化是为了显带
0 h: g! e, M/ x$ N4、100倍的油镜可以观察清晰

huangcong1988

回复 YYQ6301 的帖子
3 j/ p4 R. S. \' Z4 Z7 g+ M" S3 M
2 G$ T" C$ ?2 e# B; X+ k) q. A用秋水仙素处理细胞四个小时以后，是用胰酶消化后离心获取细胞好呢，还是直接吹起细胞好呢？胰酶处理不行吗？感觉要吹起细胞很难啊，细胞贴壁很好，很难吹打下来，还有就是除了第一次离心，之后离心都看不到沉淀，正常吗？师兄说是整个过程可以一直看到沉淀的，我就第一次能看到沉淀，但是加了低渗溶液之后的所有过程都看不到沉淀，问题出在哪呢？

huangcong1988

回复 ontheway_hit 的帖子
( C. Z1 o& \# e+ o0 T; f" x1 |: k. W% j2 o
- h: N# I2 M, Z( y1 G- ~用秋水仙素处理细胞四个小时以后，是用胰酶消化后离心获取细胞好呢，还是直接吹起细胞好呢？胰酶处理不行吗？感觉要吹起细胞很难啊，细胞贴壁很好，很难吹打下来，还有就是除了第一次离心，之后离心都看不到沉淀，正常吗？师兄说是整个过程可以一直看到沉淀的，我就第一次能看到沉淀，但是加了低渗溶液之后的所有过程都看不到沉淀，问题出在哪呢？

YYQ6301

我们都是胰酶消化后离心，整个过程离心都能看到沉淀的，你的会不会是低渗作用时间太长了呢

huangcong1988

回复 ontheway_hit 的帖子
* @4 r! q; S' @9 t' V/ l
- f6 w2 K, d1 h还有一个问题就是：你们一般怎么配秋水仙素的？因为我买的是1g的，所以先加入50mlPBS，然后再稀释10000倍（具体就是10倍10倍稀释），然后吸取400μl加到7.6ml的新鲜培养基中，直接用，这样行吗？总感觉不能混匀啊，就是秋水仙素量是不是少了点呢？终浓度0.1μg每ml是不是这样配的呢？第一次做，望指教

huangcong1988

回复 YYQ6301 的帖子) _7 w/ \* @# J( j

$ S% F! P: A* H" Q' k7 x, l* @还有一个问题就是：你们一般怎么配秋水仙素的？因为我买的是1g的，所以先加入50mlPBS，然后再稀释10000倍（具体就是10倍10倍稀释），然后吸取400μl加到7.6ml的新鲜培养基中，直接用，这样行吗？总感觉不能混匀啊，就是秋水仙素量是不是少了点呢？终浓度0.1μg每ml是不是这样配的呢？第一次做，望指教

ontheway_hit

回复 huangcong1988 的帖子+ P3 J& \# ~- X( }# ^5 m. l
# N  k! s. _: H% |- M
称取10mg秋水仙素，溶解于100ml生理盐水中，即为100μlg/ml，过滤除菌，分装到1.5mlEP管，-20度保存。一般的介绍里就是这么配的。你一次把1g秋水仙素都用了，是不是太浪费了？估计没人会这么配的。