nanodrop2000

如来的观音

大家做蛋白定量到时候，有没有用nanodrop2000（protein A280）测过浓度的？出来结果什么情况代表可用。

lazyworm

我们的NANO2000只用来测核酸，没人测蛋白用呢，测核酸的数值大家都觉得不是很准。我们也是用brandford法在那种比较古老的手动往外拉的那种分光光度仪上测。

liyan

同意shiyi 的观点。核酸污染对western的影响不大，我们做western 都是提取细胞的全部cell Lysate,里面肯定很多核酸，做western也很好啊。建议买蛋白定量试剂盒确定蛋白浓度上样。

amigel

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nanodrop测蛋白当然可以，我们都是用所谓mini-BCA法，10微升BCA工作液加10微升蛋白样品混合，37度保温30分钟后测562nm光吸收值，当然要做标准曲线。其实Nanodrop的操作手册中讲得很清楚了。当然Nanodrop还可以用其它方法如Bradford等测蛋白浓度，但是一般用来做Western blot的蛋白样品都含有去垢剂如SDS，Triton -X100,NP40等，BCA法中它们的干扰较小因此比较合适。

巴黎没有摩天轮

个人认为直接用nanodrop测蛋白不是很准确，几次测量数值也相差很大。如果精确需要还是BCA测蛋白浓度吧。。。

如来的观音

回复 langziforever 的帖子' [8 p; _* }% Q9 m% ^: ?5 ^, @9 P
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十分感谢!

langziforever

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6 q: O% O; H8 [3 m不好意思，刚看到，最近太忙，很少来，关于测蛋白浓度，我看你后面的帖子是要做western的，那就是总蛋白，这个我看他们直接就是测A280就好了，但其实做western总蛋白浓度的测定最好通过内标来矫正一致，这在发文章是最容易被认可的。而如果你要测单个纯化后的蛋白浓度，我们用盐酸胍变性后，测A280，方法很简单，就是加8ul 6M GdHcl+2ul 蛋白样品，65度，10min后，测A280，然后记得乘以5！但是在用nanodrop测的时候，你在主菜单选择蛋白样品后，然后样品类型默认的是1Abs=1mg/ml，在这里你在下拉菜单里选“others”，然后下面会出现两个让你填的空位，一是“ε”，一个是“MW”，前面的是要填摩尔消光系数，每个蛋白质都不一样，你可以去下面这个网站输入你的蛋白序列去计算“http://www.scripps.edu/~cdputnam/protcalc.html”，后面那个就是分子量了！这个方法测定的蛋白浓度可以说是很准的，估计比它还准的就是凯氏定氮法了！我们在要求高时，都用这个方法，而平常就直接测A280就好了！

shiyi

回复 如来的观音 的帖子0 a- k" g' g3 n$ U/ [# e+ H. m

- z  A- Y- Z- D' ]' i" C$ K我不清楚你的实验目的，western本来就只是个半定量的方法，误差很大，你这样做没有意义。不要怕麻烦，前期的工作没做好的话对后面的工作影响很大，后面的工作做得越多错的越多，要返工的东西越多。

如来的观音

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& n* w2 M1 b; _" f* i, c& @  v0 F- [+ y) C
您说能这样吗？按测得的浓度先上样，westernblot完了后，依照内参条带的亮暗程度再略微调整（相比暗点的就多加点上样量）。

shiyi

回复 如来的观音 的帖子$ I! h7 o8 K  m7 ?; p! z# l

6 |& A' c+ H  S9 Z7 _8 T- w1 v# z核酸污染对western的影响倒不大，不过你的浓度测不准的话没法做蛋白的定量分析啊（没法确定蛋白的上样量）。这种情况我建议用brandford法测浓度确定蛋白的上样量。