关于MEF制备的小疑问

your1024

请问一下，养的MEF里面混有杂细胞，比如上皮样的细胞，还可以用来做饲养层么？如何避免取到杂细胞呢？取胎鼠的时候一只一只的取，总感觉后面的胎鼠在PBS里泡的时间长了，内脏什么的都不好分离了。请教！

cochongg

:L只要没有污染，混有一点杂细胞没问题，应该传下代，或者冻存复苏就不见了杂细胞了。置于你怎样会混进杂细胞，我也不确定，要看你操作过程。
4 |% `' Y3 K; @! H" c但是有种可能是，你取得胚胎太成熟了。细胞分化较为全
% r8 A2 l: j) R8 K1 A再说内脏不好分离应该和泡PBS太久没有太大关系，
# W: z' B$ p' z$ o% [9 k9 n/ y0 L2 x: L
或者这样说吧，泡太久确实不利于实验，一般30分钟分离玩15个胚胎速度就算ok。; n0 F. ~7 I& a) m0 G
弯头镊子一夹住就去掉了，宁可牺牲一点，也不要残留内脏。
* l' P* |7 L  C- O8 N这个还是：熟能生巧。* }; H1 }# o' W* t9 T  X

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cochongg

给你发个步骤参考一下:)4 W  r  o4 c% i8 |6 ~# E
( E- Q- T$ G. `/ P

# o7 j. N, {' M& u1.MEF的获取：（步骤4－12已经进行实践）
7 l8 [* \8 x- b" g% S; C0 c9 s（1）激素处理小鼠，同期发情和超数排卵/ ~. N  b( s3 |) J
（2）2：1合笼过夜(雌：雄)*
5 [( J7 D( G0 \) ]! _0 d（3）取出有阴道栓（即乳白色或淡黄色冻胶状物，确定其已经怀孕）的开始记时间为0.5天 $ g: A' S, }' E( e
（4）取出妊娠12.5-14.5天的小鼠为实验材料( Y, @( F/ U+ B9 ?) t- L7 S5 t3 E5 {2 L& R% d
（5）颈椎脱臼法处死孕小鼠，放于盛有75%酒精的烧杯中消毒，拿到超净工作台上解剖，先剖开腹部皮肤，暴露子宫，然后换另外一套手术器械，用眼科镊提起近子宫颈端,分离子宫系膜,剪断子宫角，取出子宫，置于装有PBS的培养皿中。
& j/ \; z4 @2 e; P: _' { （6）取出胎鼠，在PBS中洗涤数次。去除头、尾、内脏和四肢，仅留躯干部。在PBS中充分漂洗，弃除红细胞。(用两个镊子配合即可除去羊水膜、胎盘、头尾、内脏、四肢)（若是想培养神经干细胞，则用剪刀剪取前脑进行培养即可）（可以一起处理多个胚胎）' G% m& c8 c6 m" J
（7）在新的培养皿中加入少量PBS，放入躯干部分，用眼科剪刀剪成1mm3以下的组织块碎片（可以剪的更碎一点，下步的消化时间就可以缩短）。. T. P& e, s5 o% `0 b3 L# b z. j* p8 Q* v4 f/ |/ u3 A
（8）加入2~4ml 0.25%胰蛋白酶，培养箱中消化10—15min，消化结束后加入等体积（多加点也行，只要不是少加，保证彻底的终止消化反应）的MEF Medium终止消化反应，轻轻吹打，使细胞分散。（做原代消化的时间稍长，胰酶用量也大，若是做传代，则只需加入500微升，最多1ml的胰酶，消化1~3min。）（躯干组织不易消化，做原代和传代时，故都用0.25%胰蛋白酶；而脑组织较易消化（脑肿瘤组织），原代和传代都用0.05%胰蛋白酶。）（消化可能不完全，也可室温静置5－10min，弃组织块，这样下面过滤就相对容易。）（如果消化得到的细胞太少，可以离心弃上清，PBS洗涤，重新加胰酶消化）（胰蛋白酶，Trypsin ,最适条件pH8.0，37度，溶液中钙镁离子和血清会降低其活力，故消化用的胰蛋白酶中加入了EDTA。消化结束时加入含血清的培养基即可终止反应）
9 j) J% T  x, ~! H- ] （ 9）将收集的细胞悬液离心，1500rpm， 4min，弃上清，加入红细胞裂解液（3~5倍体积的细胞体积），轻轻吹打1min，离心除上清，若仍有红细胞残留，则须继续进行红细胞裂解步骤。 i6 F- J, J3 b, y. [+ E- k7 `" w4 j. g9 s: u; }$ d
（10）离心，弃上清，重悬细胞，过滤（200目筛网）并收集滤液，离心除去上清。$ x. J' Z5 v s
, E9 }3 N3 P2 d. n2 `# C（11）用MEF Medium洗涤沉淀，离心除上清，重悬细胞，铺板即可。置于37度5%CO2饱和湿度培养箱中培养。（一只老鼠会有多个胚胎，得到的单细胞，可铺到三个培养皿中或者更多的培养皿中进行培养）9 P. ^* m; x, K) m" B
: g% ]! h6 k5 d! S5 b" `（12）第二天换液，随后每2天换液一次。培养2～4d后，MEF接近汇合，即可按1:3比例传代培养。6 s5 ~* C' H/ n" r) v/ F7 w' Y$ a4 s: L8 Q$ }6 _
( j" K- w* `" K) N  w9 x7 _/ G8 S1 I+ \8 k
要点: 无菌是操作关键, 动物皮毛不能直接或间接接触到子宫, 分离子宫时必须换用另一套无菌的眼科剪和眼科镊。培养同一株胚胎干细胞最好延用相同品系小鼠来源的成纤维细胞。9 l( a. }; _! p# {0 K# `4 P1 h8 H2 q+ O
要点: 仔细观察原代细胞有无被杂菌污染的迹象, 并且检测支原体, 确定无污染后传代扩增。
& S. Z* U& v$ Q4 }

huangcong1988

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: G# F+ Z+ _0 `  i
4 V% g# ?4 i1 P  T想问一下，就是一般一只孕鼠一般就是十几个胚胎吧（比如说有12个胚胎），那么去掉四肢，内脏，头以后，一个胚胎里面加多少胰酶（0.25%）呢，是2~3ml吗？如果说12个胚胎的话，是不是要加24~36ml胰酶？可以把所有胚胎都置于一个50ml离心管中，然后一起加胰酶么？还有就是最后终止消化是加多少MEF 培养基呢？最后是用多大的瓶子分装得到的细胞悬液呢？T25还是T75呢？大概能得到多少瓶细胞呢？比如T25瓶

ligangtiancai

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' |6 Q) q8 A# N; A( q0 b; ^0 ]  t: X7 ^" T& u( D) p
我的经验是：
3 \6 S+ G, R& Y+ j% j    去掉四肢、头、内脏和尾巴，将躯干转移至新的培养皿中，加入几滴胰酶，剪切20~30下，然后转入T75 Flask中，按照每个胚胎1ml的量加入胰酶，适度吹打后直立放入37度孵箱消化5分钟，取出后充分吹打后加入MEF培养基终止，按照每个T75瓶2-3个胚胎分装。3~4天后按照1:3传代

cochongg

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: a0 o6 T! `( H7 g# C6 f5 f% p4 E
:)每个胚胎800-1200mL，终止时用MEF培养基是两倍胰酶体积，50ml的离心管一个就可以容纳。
: H5 ~: P3 Y* r* c1 c# A: e2个胚胎接一个T75，建议不要用T25接

your1024

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9 l0 y8 `  j% A1 j$ X: D# F  P3 I; q: |- f
我就是感觉拿镊子夹的时候内脏不是那么容易破出来，所以才怀疑是不是泡久了不好处理了，刚开始的时候是很容易的，时间越长越不好处理。看来还是要多做，多练。

cochongg

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- U" K5 N5 T0 {3 z4 j* P
:):loveliness::)

your1024

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5 I! A4 J9 s" t" \  h# k0 X8 _. }7 j# Y$ U0 E# l
1、激素处理是必须的么？主要是用什么激素处理？PMSG和HCG？4 G: ]. r' n) @
2、消化时间要这么长么？这么长时间会不会对细胞有影响？
  `* n5 ~4 V4 \; T4 \9 Z  Q3、红细胞裂解也是必须的么？用什么裂解液呢？自己配还是成品？有什么成品推荐呢？% c& `$ Y6 s* W; J7 O
每个胚胎800-1200ml？？可以所有胚胎放在一起进行处理么？一起消化，然后按比例分配？用一个胚胎一个10cm的皿可以么？9 P' L/ w  b+ {
问题有点多哈！谢谢指教！

your1024

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- e. A' `( Q- x. Y6 P' T* w- Q
# D9 O) d" T/ p0 Y请问一下，“然后转入T75瓶”是怎么回事呢？消化后吸到T75瓶里，然后再终止？T75瓶一般要加多少ml的培养液呢？那到P3、P4的时候做成feeder的时候从T75的瓶里转到10cm皿的时候要按什么比例呢？谢谢指教！