关于MEF制备的小疑问

your1024

请问一下，养的MEF里面混有杂细胞，比如上皮样的细胞，还可以用来做饲养层么？如何避免取到杂细胞呢？取胎鼠的时候一只一只的取，总感觉后面的胎鼠在PBS里泡的时间长了，内脏什么的都不好分离了。请教！

cochongg

:L只要没有污染，混有一点杂细胞没问题，应该传下代，或者冻存复苏就不见了杂细胞了。置于你怎样会混进杂细胞，我也不确定，要看你操作过程。6 o- }& Q* l- S* Z
但是有种可能是，你取得胚胎太成熟了。细胞分化较为全
: q$ e; E1 J+ c8 H/ B' j1 G# M再说内脏不好分离应该和泡PBS太久没有太大关系，) @# s9 T2 {: {' \6 P# i9 I
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或者这样说吧，泡太久确实不利于实验，一般30分钟分离玩15个胚胎速度就算ok。9 V' z0 a% B% @
弯头镊子一夹住就去掉了，宁可牺牲一点，也不要残留内脏。0 G; u3 c5 Q, C! m4 Q. D" [& v
这个还是：熟能生巧。
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cochongg

给你发个步骤参考一下:)
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5 P# a9 T$ J6 k4 s& }. y8 K1.MEF的获取：（步骤4－12已经进行实践）
* ~) `/ N7 J: o6 o+ w（1）激素处理小鼠，同期发情和超数排卵6 n9 G( W. B# O
（2）2：1合笼过夜(雌：雄)* - n' F$ [3 J1 p( [# |8 A
（3）取出有阴道栓（即乳白色或淡黄色冻胶状物，确定其已经怀孕）的开始记时间为0.5天 6 G( S: O  Y4 p
（4）取出妊娠12.5-14.5天的小鼠为实验材料( Y, @( F/ U+ B9 ?) t- L5 n, d9 u, b: k0 H% g! d+ S, n# j0 F! d
（5）颈椎脱臼法处死孕小鼠，放于盛有75%酒精的烧杯中消毒，拿到超净工作台上解剖，先剖开腹部皮肤，暴露子宫，然后换另外一套手术器械，用眼科镊提起近子宫颈端,分离子宫系膜,剪断子宫角，取出子宫，置于装有PBS的培养皿中。8 N# u6 U8 Y% S0 b
（6）取出胎鼠，在PBS中洗涤数次。去除头、尾、内脏和四肢，仅留躯干部。在PBS中充分漂洗，弃除红细胞。(用两个镊子配合即可除去羊水膜、胎盘、头尾、内脏、四肢)（若是想培养神经干细胞，则用剪刀剪取前脑进行培养即可）（可以一起处理多个胚胎）
6 o8 ~2 J8 k) F8 e （7）在新的培养皿中加入少量PBS，放入躯干部分，用眼科剪刀剪成1mm3以下的组织块碎片（可以剪的更碎一点，下步的消化时间就可以缩短）。. T. P& e, s5 o% `0 b3 L# b z* W8 p+ H5 b5 l* d8 n) b+ k
（8）加入2~4ml 0.25%胰蛋白酶，培养箱中消化10—15min，消化结束后加入等体积（多加点也行，只要不是少加，保证彻底的终止消化反应）的MEF Medium终止消化反应，轻轻吹打，使细胞分散。（做原代消化的时间稍长，胰酶用量也大，若是做传代，则只需加入500微升，最多1ml的胰酶，消化1~3min。）（躯干组织不易消化，做原代和传代时，故都用0.25%胰蛋白酶；而脑组织较易消化（脑肿瘤组织），原代和传代都用0.05%胰蛋白酶。）（消化可能不完全，也可室温静置5－10min，弃组织块，这样下面过滤就相对容易。）（如果消化得到的细胞太少，可以离心弃上清，PBS洗涤，重新加胰酶消化）（胰蛋白酶，Trypsin ,最适条件pH8.0，37度，溶液中钙镁离子和血清会降低其活力，故消化用的胰蛋白酶中加入了EDTA。消化结束时加入含血清的培养基即可终止反应） ; v; a: T4 n, Q: q
（ 9）将收集的细胞悬液离心，1500rpm， 4min，弃上清，加入红细胞裂解液（3~5倍体积的细胞体积），轻轻吹打1min，离心除上清，若仍有红细胞残留，则须继续进行红细胞裂解步骤。 i6 F- J, J3 b, y. [+ E- k7 `
% j, b" z: b  v9 }（10）离心，弃上清，重悬细胞，过滤（200目筛网）并收集滤液，离心除去上清。$ x. J' Z5 v s
% a, ]; s2 d2 Q( @! J! Q. n（11）用MEF Medium洗涤沉淀，离心除上清，重悬细胞，铺板即可。置于37度5%CO2饱和湿度培养箱中培养。（一只老鼠会有多个胚胎，得到的单细胞，可铺到三个培养皿中或者更多的培养皿中进行培养）9 P. ^* m; x, K) m" B6 O* p* Q1 Z  y. S5 Q
（12）第二天换液，随后每2天换液一次。培养2～4d后，MEF接近汇合，即可按1:3比例传代培养。6 s5 ~* C' H/ n" r) v/ F& m; }; V. q& O4 M$ \8 m- r
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要点: 无菌是操作关键, 动物皮毛不能直接或间接接触到子宫, 分离子宫时必须换用另一套无菌的眼科剪和眼科镊。培养同一株胚胎干细胞最好延用相同品系小鼠来源的成纤维细胞。9 l( a. }; _! p
1 C2 e; x1 I# k7 U要点: 仔细观察原代细胞有无被杂菌污染的迹象, 并且检测支原体, 确定无污染后传代扩增。3 X* z, F7 l, Z9 V& Z% T& w% j

huangcong1988

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8 x- {5 c- E4 y想问一下，就是一般一只孕鼠一般就是十几个胚胎吧（比如说有12个胚胎），那么去掉四肢，内脏，头以后，一个胚胎里面加多少胰酶（0.25%）呢，是2~3ml吗？如果说12个胚胎的话，是不是要加24~36ml胰酶？可以把所有胚胎都置于一个50ml离心管中，然后一起加胰酶么？还有就是最后终止消化是加多少MEF 培养基呢？最后是用多大的瓶子分装得到的细胞悬液呢？T25还是T75呢？大概能得到多少瓶细胞呢？比如T25瓶

ligangtiancai

回复 huangcong1988 的帖子3 T: I+ R. x5 u1 i$ M

0 [9 Z% f9 g0 I1 c; ~, P( p我的经验是：
' v- R7 R; X' d  t2 a* H; W5 J    去掉四肢、头、内脏和尾巴，将躯干转移至新的培养皿中，加入几滴胰酶，剪切20~30下，然后转入T75 Flask中，按照每个胚胎1ml的量加入胰酶，适度吹打后直立放入37度孵箱消化5分钟，取出后充分吹打后加入MEF培养基终止，按照每个T75瓶2-3个胚胎分装。3~4天后按照1:3传代

cochongg

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:)每个胚胎800-1200mL，终止时用MEF培养基是两倍胰酶体积，50ml的离心管一个就可以容纳。" l( d+ h* r" z3 U$ H9 @, T1 ?/ O
2个胚胎接一个T75，建议不要用T25接

your1024

回复 cochongg 的帖子4 s7 j: o  q, h$ B  W
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我就是感觉拿镊子夹的时候内脏不是那么容易破出来，所以才怀疑是不是泡久了不好处理了，刚开始的时候是很容易的，时间越长越不好处理。看来还是要多做，多练。

cochongg

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# l0 A" C; h6 c6 V' \: D:):loveliness::)

your1024

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' z3 w. `! w) q/ I/ b. l  v! Q. p) O. B$ K1 r* q( Y
1、激素处理是必须的么？主要是用什么激素处理？PMSG和HCG？5 ~1 u* M' g+ N0 I
2、消化时间要这么长么？这么长时间会不会对细胞有影响？
% f4 I8 F2 E7 o/ p3 `, P3、红细胞裂解也是必须的么？用什么裂解液呢？自己配还是成品？有什么成品推荐呢？
, R4 c" J( q# E" t" _5 U5 h每个胚胎800-1200ml？？可以所有胚胎放在一起进行处理么？一起消化，然后按比例分配？用一个胚胎一个10cm的皿可以么？4 C# n& \1 A7 d9 v4 {9 o
问题有点多哈！谢谢指教！

your1024

回复 ligangtiancai 的帖子5 H) m9 J6 ]! u! N

" c! Z9 y# y/ {: @* U2 `5 `6 V( g请问一下，“然后转入T75瓶”是怎么回事呢？消化后吸到T75瓶里，然后再终止？T75瓶一般要加多少ml的培养液呢？那到P3、P4的时候做成feeder的时候从T75的瓶里转到10cm皿的时候要按什么比例呢？谢谢指教！