【请教】外周血分单核细胞培养DCs的详细步骤

wagumaxida

6 \( p; T8 _. [  |
- n+ A! r. k; }/ o- e
主要有几个问题亟待解决( R$ W" ~( |. S8 X3 ~" @7 w5 Y( k
1.外周血分淋巴细胞时，梯度离心去除血小板时，离心梯度是怎么设置的？, x+ [% {0 y4 r& O" y
2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：
/ l2 ]! B) _# R" x  A.贴壁时需要加血请吗？需要加细胞因子吗，需要的话加哪些，量是多少？
( m5 q( a/ j* w1 R& }: h  B.贴壁时间是多长时间，2h还是48h？) M3 S/ B, z! a4 ]: H. q* M1 T
  C.贴壁时是在培养瓶中好还是在六孔板里好？
1 P+ C8 j& \2 }( I7 ]. G1 k, i# m" Q% H  D.这一步还有什么要注意的吗？
0 B) L2 E5 U! @% d( d1 W- f3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：
# Q) V( j9 z: k: r( b2 C  A.换液间隔怎样？半量换液还是什么其他方式？  A& T0 O/ F# ~% @5 w
  B.换液时所用培养液中因子的量是多少？' v4 U% M* O+ q
4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步：7 q  w6 [7 b0 ]0 p+ D
  A.在第几天开始诱导？, N  r- y- ~8 q+ `) n8 F' G
  B.用什么因子或者药物进行诱导，量是多少？. K- a# n8 q6 D5 t+ |, Y" {
  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4之类的吗？. b$ O+ `& P6 i; |+ o+ R
  D.诱导多长时间可以收获？
+ u* i2 ~  `5 JP.S. 如果要用荧光腺病毒感染的话，在第几天哪个阶段感染会比较好？
9 U4 D% v. B" e9 s  \; \2 B
2 Y; x7 n$ \8 F: q  o* Q7 e- {非常感谢！

zhenhuale

同样的疑问，培养的过程中一直存在

luoziwei

持续关注

大少爷

1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10min。
# \$ m" |. G" c4 q2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：
0 _4 x7 ~$ A% j+ t A.贴壁时不加血清，不加细胞因子。3 k/ S( u7 t1 A: W0 C7 \- v
B.贴壁时间是2.5h) W) T& ^, _! |
C.贴壁时是在培养瓶中或培养皿。
* L& j) }: E$ `1 a8 Z
) |/ S( o" X. S3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：
1 J$ X0 X' T: v: H2 |# ? A.换液间隔一到两天，半量换液0 j5 M% |) Z, w  g3 l1 a
B.换液时所用培养液中因子的量是1000 U /ml的GM-CSF和1000 U /ml的IL-4
/ l+ t: F' x" d  S4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步：
* u, ?7 S, ?. O6 q: q2 h2 @ A.在第五天开始诱导& H% T- D2 @* y, g6 z8 y* q4 {
B.用TNF-α进行诱导，量是50ng/ml。9 i1 I6 i( n- u$ T
  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4。
; v1 J/ R" c8 U# u5 Z7 y  D.诱导一到两天，显微镜下观察细胞，细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养，可以收获。

大少爷

1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10min。- A% O9 z. i5 i
2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：
+ v/ p/ ]  g$ z' B6 j A.贴壁时不加血清，不加细胞因子。
% Y; V3 D. c# V, l/ t% n2 O9 o B.贴壁时间是2.5h. J% N% ?) w! t7 d$ r
C.贴壁时是在培养瓶中或培养皿。
) [' }- P7 g2 H9 k$ z  y& B% {' f# Y' p; F' m
3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：0 Q/ u  u- y, q5 W0 S/ d, v9 R4 c
A.换液间隔一到两天，半量换液" R9 H. ^9 z& y- w# Y( n; Y" i
B.换液时所用培养液中因子的量是1000 U /ml的GM-CSF和1000 U /ml的IL-4
/ {- n* o0 Y9 @9 s2 H0 i5 s4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步：
- k' A& S7 U5 q' G# o A.在第五天开始诱导' D# T- t( ~: ?4 j) t' p
B.用TNF-α进行诱导，量是50ng/ml。, W: N: D# S9 l% c/ ^
  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4。
; G% r; D* C$ o5 n! I  D.诱导一到两天，显微镜下观察细胞，细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养，可以收获。

wagumaxida

大少爷 发表于 2012-5-18 22:16
$ A( ~0 S4 A1 O+ K" Q8 s  ~7 o1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10mi ...

# o( C: H! Z; \* [感谢 另外收获后的维持培养也需要加细胞因子吗？ 需要加什么

hwlightning

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. D# n0 E4 j5 e请问下GM-CSF,IL-4和TNF-α国产的就行还是要进口的？能推荐下厂家吗？

vanessa

大少爷 发表于 2012-5-18 22:16 , H* y: r' u: @( E
1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10mi ...

  S- I! b1 B) `  n4 y9 `# I第一步我们一般是根据淋巴细胞分离液说明书来进行操作的，一般国产和进口的Ficoll离心力会有所不一样。

hwlightning

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, C. Q2 M0 V7 v6 V! f: l: r' ^' |6 K
活性单位U与质量单位ng怎么换算啊？

大少爷

活性单位U与质量单位ng好像没有换算关系，每种抗生素好像都不一样。。。