【请教】外周血分单核细胞培养DCs的详细步骤

wagumaxida

3 [. M5 c' N! v
9 |2 x$ ]( u0 [4 y7 C
主要有几个问题亟待解决
/ x, A" P+ U' d; z* E1 O0 ?1.外周血分淋巴细胞时，梯度离心去除血小板时，离心梯度是怎么设置的？
7 g& X$ ?" E5 s2 U- B$ y( y% t6 b6 a2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：; p8 L* @5 w( c% q2 y0 f  {
  A.贴壁时需要加血请吗？需要加细胞因子吗，需要的话加哪些，量是多少？2 x3 c4 \0 {0 w: N/ E
  B.贴壁时间是多长时间，2h还是48h？
" z- i, n7 B0 B  C.贴壁时是在培养瓶中好还是在六孔板里好？" `% l# o  {2 _0 R- P$ k
  D.这一步还有什么要注意的吗？
; n' m3 B5 Y4 i# A/ |& _2 z6 T, h  ]3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：
3 [: B" V. j2 n1 E! X% V  A.换液间隔怎样？半量换液还是什么其他方式？1 P6 {" c: X5 n) v
  B.换液时所用培养液中因子的量是多少？# k) {. z) j' ~; T
4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步：
3 s4 {3 n8 t4 F  A.在第几天开始诱导？( o& ]4 m6 b' O; N" k  q. q. t9 p
  B.用什么因子或者药物进行诱导，量是多少？
7 C. ]: J! d, ]  Q# h# u  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4之类的吗？9 b, T. V0 l' }- p2 {  [
  D.诱导多长时间可以收获？9 ?; ]" q1 |) i7 q$ d
P.S. 如果要用荧光腺病毒感染的话，在第几天哪个阶段感染会比较好？
6 E! A2 [( R" p5 G2 i
" p1 {- M; w; L6 a- A' E! {7 ^非常感谢！

zhenhuale

同样的疑问，培养的过程中一直存在

luoziwei

持续关注

大少爷

1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10min。  `" k& q8 X+ [4 i+ m0 I
2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：' a/ d9 y1 A; k1 ]. [
A.贴壁时不加血清，不加细胞因子。
* d% n! Z) V* W( F  z' @5 T B.贴壁时间是2.5h
$ z; F1 }6 I) e1 U5 l* Z C.贴壁时是在培养瓶中或培养皿。/ J: V& t# H! n. b1 C! K9 j4 w
+ w+ R$ @6 ~. Y7 e
3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：
( P  M: A! r- @8 b+ o A.换液间隔一到两天，半量换液% _; m, W$ m! r
B.换液时所用培养液中因子的量是1000 U /ml的GM-CSF和1000 U /ml的IL-4* [; h0 x6 F5 D; D
4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步： # C' c. U4 M9 `9 R6 H/ M
A.在第五天开始诱导8 G4 d+ W% ?1 z& x; y' B, q6 B6 h  b
B.用TNF-α进行诱导，量是50ng/ml。
& ]) ?# `- t0 A# w8 {/ }  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4。
; r( ~8 o+ K+ i  D.诱导一到两天，显微镜下观察细胞，细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养，可以收获。

大少爷

1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10min。; }% j. S4 [0 J7 I/ x7 Q. {
2.淋巴细胞贴壁获得单核细胞时：
3 b$ {3 n5 M5 }8 @ A.贴壁时不加血清，不加细胞因子。
' g- F; P2 _2 ^  m) f* D* O B.贴壁时间是2.5h6 A" c% D$ k% Q3 P0 {$ v5 v
C.贴壁时是在培养瓶中或培养皿。
4 C& u8 b& @4 s7 x. `4 {6 W# j4 A5 U7 ]
3.单核细胞诱导培养成未成熟DCs这一步：9 P) s  X2 Y: |" F( ?- H
A.换液间隔一到两天，半量换液
4 h. M7 z4 a4 m( j/ r: U: U$ u/ hB.换液时所用培养液中因子的量是1000 U /ml的GM-CSF和1000 U /ml的IL-4& }% `9 q2 c6 T2 O3 `2 x" A" e$ r
4.未成熟DCs诱导成为成熟DCs这一步： 9 a  ^( l- i# m, u
A.在第五天开始诱导
, H1 Z- X6 |9 `( I; n9 B. u: X B.用TNF-α进行诱导，量是50ng/ml。) {* `* e5 w% p1 M; F1 q" J
  C.诱导时还要继续添加GM-CSF、IL-4。
6 L/ e( h7 [, C' q3 Y5 d  D.诱导一到两天，显微镜下观察细胞，细胞变为毛刺状悬浮细胞，终止培养，可以收获。

wagumaxida

大少爷 发表于 2012-5-18 22:16 ! p6 u, D0 g5 i( N
1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10mi ...

& k; X. N; P' x  B  t( R" n8 o
感谢 另外收获后的维持培养也需要加细胞因子吗？ 需要加什么

hwlightning

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$ \$ L4 a. `6 I9 b6 O6 B/ \6 h8 B
0 p( @$ i! g/ m- L请问下GM-CSF,IL-4和TNF-α国产的就行还是要进口的？能推荐下厂家吗？

vanessa

大少爷 发表于 2012-5-18 22:16
# w+ W9 [. f  [* B1 ]1.我们用久保田的离心机，第一次1500rpm（大概400g），10min，第二次1200rpm，10min，第三次1000 rpm，10mi ...

+ s5 O: z( Q. Y+ \- @, o+ ]
第一步我们一般是根据淋巴细胞分离液说明书来进行操作的，一般国产和进口的Ficoll离心力会有所不一样。

hwlightning

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* m3 ]2 C, u! ^# f" d3 S) j% B7 v! U" q% b; w8 g# ?$ I
活性单位U与质量单位ng怎么换算啊？

大少爷

活性单位U与质量单位ng好像没有换算关系，每种抗生素好像都不一样。。。