如何提取卵母细胞

spy529

用透明质酸酶消化完颗粒细胞后，如何清洗卵母细胞？具体方法

moluxingke

如果是大量收集卵母细胞，可参考08年的这篇science，PTEN和卵泡发育相关的一篇文献；
. W$ I* L0 v6 n- K1 X& L: T. f' P6 p( j大致方法如下：卵母细胞分离方法：9 T; W- w8 F% J5 a4 G
1 小鼠脱颈处死，取出卵巢，在显微镜下剔除脂肪垫和多余组织。
6 z- |7 q2 ^3 [/ ~/ U( s0 W3 d( O2 将卵巢剪碎，然后胶原酶消化，消化过程中不断吹打振动。
5 j) S1 [3 E8 ^5 s/ E# p  胶原酶溶于DMEM/F12培养基中，浓度为0.05%，培养基添加0.4%（g/ml）的BSA，100U/ml的青霉素和100ug/ml的链霉素，
+ B4 L8 r% v/ I1 r6 v5 |& j8 d3 大约40-60min以后，待组织消化基本完全，往消化液中加入EDTA至终浓度为40mM，然后于37℃孵育15-20min，期间不时搅拌，直到颗粒细胞以及其他细胞类型完全散开。
  M& v: b5 m" ?4 将细胞混合液洗涤一次，然后于上述不加血清的DMEM/F12培养基中培养12h，使颗粒细胞和其他细胞贴壁生长，未贴壁的卵母细胞和血细胞被聚集到上清液中，室温1000rpm离心5min，然后血红细胞经过低渗buffer出去，（含144mM NH4Cl和17Mm Tris-HCl Ph=7.2）。
% V+ j5 x+ P! h2 K; @5 洗涤几遍以后，离心收集卵母细胞，加入裂解液裂解后，14 000rpm 离心20min，4℃，取上清测BCA法蛋白浓度，待用。
. D  b) S* n% \2 w1 d. B- o" Q( G0 }0 Y
        具体方法参见：   Pradeep Reddy, et al.  Science，2008
, O' w( I0 w8 b% ]. k  X8 O6 H

wxl87

回复 肖特 的帖子# U9 ?1 Y) S  v5 f
! X, O% |) J1 B. |4 s  N
thank you

肖特

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  P/ Y) s. ]. h- ^  _8 t# N; J" k" G4 n! j; p, N0 V
超排冲输卵管每只小鼠可以取20-50或者更多个排卵后的卵母细胞。; s2 Y! V- s; @: s9 g, R. M. U
超排针刺每个卵巢可以取50个左右，所以每只小鼠可以取100个左右。
. n1 ]6 p8 |. `& X8 E) b! p. d- x( j! l" v- O' p0 m
针刺后暴露出的如果是裸卵，大多是正在闭锁的卵泡中的卵母细胞，所以这种卵母细胞状态会不太好。
7 Z: h: F/ u1 X8 c* e2 y3 i
; b6 S5 }5 J5 {' \: o3 X需要卵母细胞数量较多的话就多用几只小鼠。% W  i# l# Y4 c; _3 X
" A" c% x; S/ X: x1 Q4 ?/ D

spy529

小鼠的一个卵巢少的可以取十几个多的有时可达三十个
, K% z1 c: J# a, s. t

wxl87

回复 肖特 的帖子( W- p- A- C& G, q
9 H& [4 ~; k/ N
这个每次大概能取到多少个卵母细胞？

肖特

( U; W% z8 j1 B7 X- h9 j

9 v5 _/ _% U/ H0 j1 P) T回复 wxl87 的帖子5 @# y8 e7 k; }$ e8 |" h9 n+ Q+ S
2 W( q$ |( V2 ^" c
小鼠超排之后取完整卵巢，解剖镜下针刺比较明显的卵泡，卵丘卵母细胞复合体会释放出来

wxl87

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" v* N2 t9 f9 E. s
8 X# m+ I. e; r4 ~) e5 h这是小鼠的卵母细胞，怎么用针刺法？卵巢很小的。

肖特

需要排卵前的还是排卵后的？
: j4 u" }( D6 }
: ^& L# o( k. D! O/ Y! @6 _针刺卵巢可以取排卵前的卵母细胞，再根据直径区分不同时期。
# E6 S: w5 B  x5 l% f( Z: P. I# z
( t# k" X/ m" X' [收集卵母细胞置于液滴中，在解剖镜下用毛细移卵针吸取干净的卵母细胞，转移到其他液滴中。只取裸露的卵母细胞的话需要轻吹以去掉颗粒细胞。; k3 z. C* ?- D+ l7 r8 f+ K4 b
5 i. u+ g( U+ u
卵母细胞较大，离心会离破，在液滴中卵母细胞很容易沉降。
8 R9 Y: f/ u1 g1 J
7 ?# w! A7 ^6 L7 \, r7 r' g% e: \熟练的话会操作快点。

hcluo

小鼠，用PMSG和hCG进行超排处理，然后收集输卵管壶腹部膨大处的卵丘细胞，最后用透明质酸酶进行消化处理，在解剖纤维镜下，可以挑选出纯净的卵母细胞。不过，获取不同时期的卵母细胞需要不同的处理方式。