如何提取卵母细胞

spy529

用透明质酸酶消化完颗粒细胞后，如何清洗卵母细胞？具体方法

moluxingke

如果是大量收集卵母细胞，可参考08年的这篇science，PTEN和卵泡发育相关的一篇文献；
8 v) N! F) N5 b. O0 j, H' c0 p5 W' a/ @. Q大致方法如下：卵母细胞分离方法：- v( H( P% ?  @# D9 Y& i
1 小鼠脱颈处死，取出卵巢，在显微镜下剔除脂肪垫和多余组织。5 ~0 K6 v; G/ ]5 f1 m  O6 u5 E
2 将卵巢剪碎，然后胶原酶消化，消化过程中不断吹打振动。
: L4 Z# N2 i+ s7 h5 V7 ~. C  胶原酶溶于DMEM/F12培养基中，浓度为0.05%，培养基添加0.4%（g/ml）的BSA，100U/ml的青霉素和100ug/ml的链霉素，: O6 U# [0 z! T1 O  v! Z
3 大约40-60min以后，待组织消化基本完全，往消化液中加入EDTA至终浓度为40mM，然后于37℃孵育15-20min，期间不时搅拌，直到颗粒细胞以及其他细胞类型完全散开。0 t4 g% b% d& O& V2 s
4 将细胞混合液洗涤一次，然后于上述不加血清的DMEM/F12培养基中培养12h，使颗粒细胞和其他细胞贴壁生长，未贴壁的卵母细胞和血细胞被聚集到上清液中，室温1000rpm离心5min，然后血红细胞经过低渗buffer出去，（含144mM NH4Cl和17Mm Tris-HCl Ph=7.2）。
% f) Y! ]& C" x4 c1 @! U0 k7 |5 洗涤几遍以后，离心收集卵母细胞，加入裂解液裂解后，14 000rpm 离心20min，4℃，取上清测BCA法蛋白浓度，待用。! S5 W/ r; |1 d8 r/ n

' o3 W6 I" H3 n) A8 C1 C        具体方法参见：   Pradeep Reddy, et al.  Science，2008
  `0 d: Q7 X8 H+ X  I6 j* {- c  ?

wxl87

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  H  @4 r, g3 F3 d& J3 Cthank you

肖特

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) f% m& t( g5 Q$ N0 P, I
8 v8 s: V/ `/ P超排冲输卵管每只小鼠可以取20-50或者更多个排卵后的卵母细胞。* k) }, |. u, I( j$ X
超排针刺每个卵巢可以取50个左右，所以每只小鼠可以取100个左右。
, g4 c. d+ A8 Q1 L, r( \- o& r- K, H' ~% R/ |( f
针刺后暴露出的如果是裸卵，大多是正在闭锁的卵泡中的卵母细胞，所以这种卵母细胞状态会不太好。  `# g- P. p* E& k) b9 c9 V# D

: h+ `2 m' L' J) q需要卵母细胞数量较多的话就多用几只小鼠。1 T- n7 G# [6 w8 m2 K' d( x

4 Y8 Y; e  F- @3 C& S

spy529

小鼠的一个卵巢少的可以取十几个多的有时可达三十个
( E; ~) N! w' ~- E7 R: `7 M

wxl87

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7 s5 q/ }7 \+ O. M/ ]% C; a3 i2 m! ^% S% F2 y
这个每次大概能取到多少个卵母细胞？

肖特

% w1 u3 X+ T+ b# [8 U! V
0 A: I, G2 u2 u) j回复 wxl87 的帖子; D  C) G6 @* ^9 i5 X  H

$ ^9 ^8 W$ }% ?( X" I小鼠超排之后取完整卵巢，解剖镜下针刺比较明显的卵泡，卵丘卵母细胞复合体会释放出来

wxl87

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, O0 w) b% ?; v6 B7 ^8 [* |0 f+ E& W  f/ a: o; L: ?2 o
这是小鼠的卵母细胞，怎么用针刺法？卵巢很小的。

肖特

需要排卵前的还是排卵后的？! X3 s; P1 [, W

& E) w4 i# P9 N$ J6 [  w2 i针刺卵巢可以取排卵前的卵母细胞，再根据直径区分不同时期。- ~6 \' ~, `$ L/ s9 R8 @9 v" W

! T$ {2 b8 q* H8 W; n. _# @收集卵母细胞置于液滴中，在解剖镜下用毛细移卵针吸取干净的卵母细胞，转移到其他液滴中。只取裸露的卵母细胞的话需要轻吹以去掉颗粒细胞。
1 }" M: R- f; s, m1 R3 N; C' O2 S" B3 _7 n
卵母细胞较大，离心会离破，在液滴中卵母细胞很容易沉降。
& A; S  j  V1 N" O7 L: X
" d* A6 O0 W. \6 o" f熟练的话会操作快点。

hcluo

小鼠，用PMSG和hCG进行超排处理，然后收集输卵管壶腹部膨大处的卵丘细胞，最后用透明质酸酶进行消化处理，在解剖纤维镜下，可以挑选出纯净的卵母细胞。不过，获取不同时期的卵母细胞需要不同的处理方式。