请教高手：怎么才能做出好的ＥＢ呢？

刘森泉

回复 wwy551 的帖子5 T, c. [, m7 X3 \- l' B, B+ f2 r

/ b% ^3 o# W/ a0 Q请教下，养的hES很容易分化，而且一些分化了导致传代之后就有很多分化的，恶性循环了。想用枪头在显微镜下一个一个挑，但是今天试了下，实在不行啊，这么多克隆，很难挑啊。有没有好一点的办法？谢谢。

刘森泉

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5 S% U' ]7 T2 B, ]2 b& l好的，谢谢你！

wwy551

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" H/ K1 y1 i- U% y0 F
5 v7 R" B, ]1 c' ^# c% ~用collagenase代替dispase应该也可以的，我们实验室只是很普遍用dispase。: N7 A$ L2 K$ x
如果有分化的ES，看分化的严重程度了，如果很严重的话，建议还是刮掉，毕竟ES状态不够好，做出来的EB状态也难好。如果只是少量边缘分化的话，应该影响不大，经过之前降到的那种自然沉降处理，还是能够把中间的克隆跟边缘的分化细胞分开的。

刘森泉

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( `  ]0 E. x5 p& O( c1 U  a/ w( n; I& K$ U* s- D7 f$ H& T$ N! T
谢谢！请问dispase可以用collagenase IV代替吗？ES部分分化了同样操作可以去除已分化的细胞吗？

wwy551

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$ Q+ F4 [1 x; E) ^: s& }: M; r0 a! s$ {# L. G! n) }
把ES克隆用HESM重悬后接种至低贴附板上，第二天就可以开始用分化培养液分化。- ?1 N+ l; T: ?5 ^! o+ x4 S- E. G
并不需要等到EB完全形成，在分化的过程中，EB会慢慢成形的。
. a; B+ o: t' Q2 V7 u2 p. }& h( z+ ?所谓低贴附板，就是防止细胞贴壁生长的，不同于常规用的细胞培养板，比如做造血分化分选出来的CD34+造血前体细胞就可以放在低贴附板上继续培养，这样可以抑制内皮等其他需要贴壁生长的细胞的生长，也就间接促进造血细胞发生。低贴附板有商品化的，买来直接用就好，不需要其他胞外基质处理。
) Q# D; G  \' v4 T" L另外，实验室用的普通培养板如果经polyhamin处理的话，也可以当低贴附板用。

刘森泉

回复 wwy551 的帖子# g' i& j! i" F/ n7 x. _  B" i
# u4 M  ~: S- |6 ^
如果向造血分化的话，把ES接至低粘附性培养板上，第二天按步分化就可以了吗？需要在EB完全形成后转移至扩增培养基吗？低粘附性培养板要用Gelatin或Matrigel包被吗？谢谢！

wwy551

回复 wawj 的帖子  u: E0 h6 }  O2 h
- d9 i( r# b. C, X6 H; x" V
MEF当然也沉降，不过远没有ES克隆沉降的快啊，等到大部分克隆都沉下去了，吸去上面没来得及沉下去的MEF，而且这之后还会用DF12洗一次，这样也能保证很大程度去MEF。
$ c& D4 A0 t- t8 Z) Z2 j# ?/ c沉降这个不需要很在意要多长时间，看着大部分克隆都沉降了就可以了。我以前做的时候就直接把消化下来的克隆和MEF一起收集进离心管，就那么放着，然后做别的实验~~

wawj

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+ K0 \0 B" \4 Y- }0 @% b- \
8 M9 C9 T  y2 Q1 @( ]  X对，是不错。自然沉降，mef feeder不沉降吗，没这样做过，不知道。还是要沉降多长时间？

wwy551

回复 wawj 的帖子# {( M$ f6 _9 I/ d

$ U% Y- t8 n) Q2 H. ]' G( \; B/ i当然了，做EB对ES或者iPS的要求也挺高的，ES或者iPS状态要好做出来的EB才会好。. q6 k; K% t8 A# H, J
另外，我用静置沉淀ES克隆的方法去MEF的效果很好啊~~

wawj

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' g1 ?) y/ s. ~# v9 D
: x/ s, l% z6 }5 l' K6 @$ y9 `谢谢啊。可能小鼠的跟人的还是有点不一样。我跟您方法不太一样，我是离心后重悬接种到瓶子里差速贴壁两次，先20-25min,再5-10min,都是为了去掉feeder,得到相对纯的ips.您使用悬浮形成EB，我是用悬滴，听师兄说悬滴形成的大小均一，相对好一点。可我这几次做的都不行，可能还是细胞状态不够好吧。有点郁闷啊