PCR克隆基因酶切的问题

daviddow

如何解决酶切后没有条带的问题？
3 G6 r5 {6 q, pPCR产物：N426 A9 ]5 J  c7 b
1 Z2 u) i3 e# d* U1 r

6 l/ d' L; h: |6 `! I/ @6 i酶切后：PCR-N4-BamH! T  s6 ]; ~; i- d1 s2 X/ {9 K
! g4 C' k1 [4 {$ C
- y- b2 o3 j6 z! T9 ^* \/ H
  Y( a6 r6 E8 v" o. Y- R1 ?" _! X$ x
酶切的条件是：
0 q: x; [/ \9 e, X1 [  vNuclease free water     40ul  @" Q) V! m; ~$ p5 r
BamHI Buffer          5ul# y+ O; S4 A* O6 Y, E
PCR product           ul' {! L: g0 r; Y1 s; A
BamHI               2.5ul
' ?4 g6 ^! A, a' AHindIII               2.5ul
# W" D8 A, e9 `2 O②: mix gently and spin down for a few minutes;
, x1 a' L1 F/ e3 }- I1 Y③: incubate at 37°for 3hours
& K$ G6 }  q3 j: w" R

刘森泉

通过酶切其他载体检测酶是否有问题；通过PCR检测载体是否有问题；第三就是酶切反应了，这样的体系一般没有问题，因为你的BamHI Buffer不适合切HindIII，至少单酶切可以成功，一条条带至少应该有。

风雪叶杰

酶切之后没有条带？建议先检测下酶的质量问题吧，还有buffer。就算切不开也不至于把片段弄没了，只有可能是降解了，这两个酶都挺好用 的，不会有什么大的星活性

b6122

5 g1 O! M; D, t' F6 s# Z* {* t" a' a. M8 D
我切bamhi和hindiii的时候用的neb的buffer 2 （10x），我在网上搜了一下，配方如下：+ A' ~: u. C# E. q' h) C* p, W1 `& o
1X NEBuffer 2:
' M% X% f# J, T$ S50 mM NaCl- Z9 H( j' t7 e/ H
10 mM Tris-HCl$ K  j3 {& n. b. f# \6 r
10 mM MgCl2
/ T/ _+ s* H4 s4 T  V1 mM Dithiothreitol9 v: |' `7 Z- N, x( S- @# {
pH 7.9 @ 25°C, I  a2 I8 P! Q
这个buffer条件下，两种酶的活性都最高
2 X) R1 i& _0 C' h9 h! K
. F0 J# s; ]: w% v$ S另外，你pcr产物跑电泳后回收胶有没有问题？

daviddow

b6,你说的回收胶有什么问题？不知道什么意思？谢谢！我是沉淀了一下就酶切，没有跑胶。

daviddow

回复 daviddow 的帖子
, J( X9 ?+ ]3 z0 h! J# C" j; M0 `
我的是fermentas公司的内切酶，这是他们推荐的内切酶。我切了质粒以后没问题，但是PCR酶切后就没有我需呀的条带了，都到了100bp一下了

daviddow

回复 风雪叶杰 的帖子4 l. I2 v  b  o
* _) R0 V  ~. `. o' k' L5 G7 f6 @9 t
谢谢风雪，不知道哪些可以降解PCR产物？我的质粒没有问题，就是PCR产物都降解了

lazyworm

即使酶切没切开也应该有一条带吧，一点东西都没有要考虑前面的实验是否成功了。

youzi821

回复 daviddow 的帖子
7 M. y/ |# _+ U" o7 g
; y# _* M! h. g' Afermentas的酶，你看下酶的最适孵育条件和时间，超过30分钟，BamHI有其它活性，最近我也遇到这个问题，把酶切时间缩短，如果是快速酶的话，15分钟左右就可以，不要孵育那么长时间。

youzi821

而且一般情况下双酶切需要用通用buffer，请按照你买的试剂公司的条件来做。