高手请进！脐带间充质干细胞组织块法分离失败。第3-5天组织块间很多膜状沉积，求解...

quge_00

7 Y9 M# L& {3 i  J/ w# b) |
7 h+ g/ v  h( X6 n
谁能帮看看我的实验步骤：3-5cm的wharton胶养一个60mm的培养皿。7 P: r+ M; W5 y, s7 O) m' u
1、无菌收集脐带，浸没于含1%双抗（青链霉素）的4℃预冷PBS中，清洗表面血污； 9 _, K" j) u% [" L; o. t
2、灭菌棉线结扎脐带一端（1cm处），另一端固定于超净台，将脐带浸入4℃含双抗PBS的灭菌容器中；# }1 `* L. K! y
3、超净台内用手术刀片环切距线结端约0.5cm处脐带外膜（勿环切过深），用皮钳将脐带外膜整张钝性剥去；止血钳钝性剥离2根动脉和1根静脉；
3 Z# t) R3 ?! {* j8 i' a* }4、距线结端约0.5cm处切断血管和华通氏胶，再次用含双抗冷的PBS洗净血污。将华通氏胶剪碎至约1mm3，转移到50ml离心管，用PBS以1000rpm两次洗去粘液；
3 G. I8 \- P3 G" R  |5、将组织块转移到细胞培养皿中，使组织块分散平铺在培养皿上，间距为5mm，入37℃、5%CO2孵箱培养30-40分钟使组织块贴壁；
% T  i( s7 W- k$ v' k3 _' Y  c4 O6、加入DMEM/F12培养基（含10% FBS）6ml后，入37℃、5%CO2孵箱培养，5天后半量换液。

quge_00

养3-5天，组织块间就开始有一层膜状物，没有细胞结构，像是死细胞或者是蛋白沉积，一晃动就能剥落下来一层。但是总是很多，显得很脏（换培养液是感觉很粘稠，像胶水一样）。已经养了4批了，只有一个培养皿像是MSC，但是可喜的是还没传代就莫名其妙的死掉了。。。5 }+ q1 f( a% Y+ D* T. N0 \
换过FBS，培养液需要换a-MEM吗？
, F4 @9 w' ?: v6 k$ F- v

quge_00

9 w( ?. A/ B4 Q5 k9 a
! A7 X6 s, k; d# I5 v$ x底面观

quge_00

正面观

quge_00

现在问题是这层膜怎样处理呢，挂掉害怕组织块松动；留着的话细胞是不是没地方长了？6 C0 w$ v9 p3 b7 B" x
最要紧的事显微镜已经很难透光了。。。。。。* q$ W; I( x& L, I; D6 J( e
高手速来，
8 Q3 O0 V- q$ G4 t8 V5 Z# G% N感激不尽啊。。。

quge_00

回复 xxuudd 的帖子) @6 |/ T" p. a4 i0 J6 U+ g3 |
% L7 p& q: E6 I
谢谢！最近整个培养箱都出问题了，污染也非常可能。。。

quge_00

回复 单个核细胞 的帖子( M3 p5 P) s; |, o0 V' v0 I& M" [
% ^5 t. `4 K: r- n3 }& k4 c! w' s  x
非常感谢~~~最近整个培养箱都出问题了，我想也很有可能污染（还有几次长出霉菌菌落）。。。弱弱的问一下：粉碎后静置5小时不怕组织块干掉吗。。。。？？

quge_00

回复 sdwzg119 的帖子* y& |& }2 D+ f# Z& B9 m

& v4 i: d0 a& r3 \: Z非常感谢~~~最近整个培养箱都出问题了（细胞都长得很差），我想也很有可能污染（还有几次长出霉菌菌落）

quge_00

回复 jiefengbing 的帖子
( v, b  t, s2 S2 F7 D- t& z$ r; `' S2 w  h( D4 ]( \
学习了~~

quge_00

回复 Tim 的帖子
5 _; N  Z, k; K) _8 E) y8 X5 j, f' {" v) f4 Q, ^
非常感谢~~你的方法很有启发性~目的是让等基质里蛋白渗出差不多了，再去让组织块贴壁，对吗?! R% B$ G/ t. D+ [) l
还有几个问题：
7 S; ^4 b7 l  D' c0 H8 n1、组织块粉碎大小大约是多少呢,1mm3 ?  3-5mm3 ?看很多文献报道不一。2 T6 M/ C5 S9 p" f( ~
2、培养液里血清浓度为15%，还需不需要其他什么添加剂了呢？比如我看有人加地米、Vc等。您的经验呢？期待您的答复~~~