高手请进！脐带间充质干细胞组织块法分离失败。第3-5天组织块间很多膜状沉积，求解...

quge_00

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. A, c  Y, ~" h+ A" F
谁能帮看看我的实验步骤：3-5cm的wharton胶养一个60mm的培养皿。) U7 K" A! ~) S+ z! L+ |1 ?7 G! Y
1、无菌收集脐带，浸没于含1%双抗（青链霉素）的4℃预冷PBS中，清洗表面血污； ' K- N4 z" T. P! R
2、灭菌棉线结扎脐带一端（1cm处），另一端固定于超净台，将脐带浸入4℃含双抗PBS的灭菌容器中；
! M5 P  U1 K& e. [7 W3、超净台内用手术刀片环切距线结端约0.5cm处脐带外膜（勿环切过深），用皮钳将脐带外膜整张钝性剥去；止血钳钝性剥离2根动脉和1根静脉；  @  j+ i' e5 |3 _3 j
4、距线结端约0.5cm处切断血管和华通氏胶，再次用含双抗冷的PBS洗净血污。将华通氏胶剪碎至约1mm3，转移到50ml离心管，用PBS以1000rpm两次洗去粘液；
1 Y0 p7 i7 u3 r5 |& o; e- U5、将组织块转移到细胞培养皿中，使组织块分散平铺在培养皿上，间距为5mm，入37℃、5%CO2孵箱培养30-40分钟使组织块贴壁；
& h" p. W: e* l- K' d6、加入DMEM/F12培养基（含10% FBS）6ml后，入37℃、5%CO2孵箱培养，5天后半量换液。

quge_00

养3-5天，组织块间就开始有一层膜状物，没有细胞结构，像是死细胞或者是蛋白沉积，一晃动就能剥落下来一层。但是总是很多，显得很脏（换培养液是感觉很粘稠，像胶水一样）。已经养了4批了，只有一个培养皿像是MSC，但是可喜的是还没传代就莫名其妙的死掉了。。。
6 g! o  w2 ~$ B* C$ q: _换过FBS，培养液需要换a-MEM吗？
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quge_00

" S% B: x5 ^4 _# B
5 v( q5 r7 T1 D0 E2 y' r8 f
底面观

quge_00

正面观

quge_00

现在问题是这层膜怎样处理呢，挂掉害怕组织块松动；留着的话细胞是不是没地方长了？% l( ?8 d8 u. z/ i( B
最要紧的事显微镜已经很难透光了。。。。。。
6 S4 h, f( ?$ h7 R9 e高手速来，
  Q  p+ `3 s7 i0 w- M: h! j- Q感激不尽啊。。。

xxuudd

怎么会有膜呢？是污染了吧？3 j1 a9 g$ p$ s$ G' |. P7 H

单个核细胞

) E, U5 j# m% r, V
5 U; F# ^1 w8 i回复 quge_00 的帖子! S& l: a/ @" w' }. _
. d. z8 R* N( ?( d$ i) m
推测为污染，建议重做。
: h4 X% |( q4 E
: r7 I( b0 r4 x% `; n* n你可以这样试一下，不要剥外膜，先将脐带剪成小段，然后组织镊剔除动静脉，直接剪碎，贴壁5小时后加入完全培养液，静置培养。0 V; [# g8 ]- K5 m  T1 {/ ^# V

) ?/ B; r& X$ C) z7 s熟练之后再行脐带华通胶组织块贴壁培养。

sdwzg119

3 J; u+ P: Y% U4 T$ n. R  A

9 P, R- F, X- r5 _, v# F. s回复 quge_00 的帖子
. G% J: P( x# ~  Y, S: ~/ P( i
3 T7 I1 m( h  V7 ^2 h不会有膜的，我认为你这是污染了，现在组织块贴壁法样脐带MSC挺成熟的。
1 P" G4 g% R; w! N你描述的3-5天有白膜长出，这个时间正是细菌生长出的时间，你连续四次都这样，说明你无菌处理的非常不到位。5 O; H; n: |( d& W3 `' C* M0 L7 n
9 |6 ?$ r- S7 N$ Z  |8 {+ G( g; T
脐带，你光指望双抗水是不行的，它可能有非常多的真菌，我建议你多冲洗一下，起码冲洗10遍以上，去脐带的两头。

quge_00

回复 xxuudd 的帖子6 v; `" C' e# `  z; l: C% y
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谢谢！最近整个培养箱都出问题了，污染也非常可能。。。

quge_00

回复 单个核细胞 的帖子
9 d. q0 N; ^* U: j1 o) f0 C8 a" F  ]( [. w. y" I( J
非常感谢~~~最近整个培养箱都出问题了，我想也很有可能污染（还有几次长出霉菌菌落）。。。弱弱的问一下：粉碎后静置5小时不怕组织块干掉吗。。。。？？