荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

l19rna

. d$ J, r6 m- ]( V

5 i6 H+ j7 V- ]' a# h# b最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？
- m6 k6 @5 r. @" d! c" _# X  J  w. ?" ]- F( K1 u
看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。2 l& V: s, W) }: H4 |, Y1 q6 F( W
不知道是否有探针数据库可以查询？
% h& n; a  D" q  `- H% Q0 m& Y. r4 U/ }" i! O
自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？/ X- V4 R6 c+ p& r1 L  P; G

3 L+ ]# C7 t1 o! v求高人指导~
+ u0 y& z% P! X# U. j5 x( d: k

妖妖空

NCBI不行吗？

l19rna

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# f/ k: `* ~$ X4 ]* Q可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

weiyepan

) r6 C1 [/ J7 e4 X9 B3 Q1 A5 B( c3 }' u
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。
! O& \& X1 f; i/ J用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。2 L8 g- s! Y+ j$ m" R, t& }) h# o
上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。
! g3 e8 p3 s& a, W+ h' v standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

2012-7-16 21:30 上传

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l19rna

回复 weiyepan 的帖子# R. ]: v" |6 Y- D5 H

3 f+ I/ a7 n* y' h果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

kkmmkkmmkk

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27 & c! u7 R, U8 m: t" s
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

8 r% ~/ p. ?) X" X0 f2 X
附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

细胞海洋

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* e1 X- M- c4 P# g: i. A% B参与讨论 获得积分

s1002297748

给力

huangxf1998

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。/ D5 `( @' f: Z! f/ c9 n
TA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。
% D; e* j5 r4 {& n3 R; \4 @几点注意：
0 K9 O2 X. T9 X. ^# Q: `1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。6 o2 ]/ |+ y& l3 P1 T9 f
2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。
7 p5 k  E+ m% n) x$ M  s7 w3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。
' C+ M! g2 t5 {+ d$ c& Z  F4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。
: R* V, S2 b3 J1 A4 \3 p

l19rna

回复 huangxf1998 的帖子: v( o8 S1 F# T* I/ a

0 l. @$ ^- M* X% B第一次已经失败了啊，唉，呵呵