荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

l19rna

* w4 t8 W. {" k" d& T/ q
$ P- B+ {3 Y& @' c0 k
最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？6 Q' `. k2 s1 J) }: e

0 }) \  c# H, G, {* W6 v看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。
3 }* a4 W+ W$ f! H( s) B/ R不知道是否有探针数据库可以查询？
2 }* d, a- M( G9 o# ?& s/ |9 @, W2 U" N2 K3 i6 m' d' |1 {
自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？
, v; v. ^3 m# y) R0 a. V1 I6 O
- K( w& F9 A) Y: [! L/ e( U* a求高人指导~
: e( a1 V; n8 M& h0 d9 s  r( s3 C$ x4 m

妖妖空

NCBI不行吗？

l19rna

回复 妖妖空 的帖子6 w, D; W: v2 P. R

( b) r) H6 X( C' S8 n6 ^' @* W可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

weiyepan

% T- ^* Q  U2 a1 E7 k; C8 O" X) J1 ?; S- @! b+ |2 Q7 G
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。
8 R( ]' N. s* H用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。' L5 q: Q; y" X2 }) z3 h* H& O, d
上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。
  {3 v- K) f8 I# z/ r$ V6 g standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

2012-7-16 21:30 上传

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l19rna

回复 weiyepan 的帖子% B6 l' O# t  d1 d# P- f: [
( R3 H) c9 M7 u  \9 a! L
果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

kkmmkkmmkk

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27
- w" K; T7 e6 Y# R/ B2 |: c如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

' X' [6 T8 c0 S  W
附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

细胞海洋

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$ i' l  ~  g/ N6 @; I. v  y% X参与讨论 获得积分

s1002297748

给力

huangxf1998

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。
- s8 k1 J% i9 y2 M4 kTA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。
" E: R8 U/ r* {$ F6 ?: D/ j几点注意：
5 [0 `8 v9 A+ H/ z0 Y* x' }1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。0 k' F' o6 }: O* }3 P3 }7 u. |8 M9 @
2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。. B: [) E0 M  T. f& ]) j
3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。
/ A) G2 b9 e! P4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。5 V# A, Q  c  U9 |' c5 f: A" Z

l19rna

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( \9 u3 x" G* b
; R# O. V/ n7 x4 I! t$ |! D0 z第一次已经失败了啊，唉，呵呵