怎么通过基因表达来检测细胞凋亡？Fas和Bcl2，bax，BclX能不能检测？

jiojoo

! B3 F% o) H2 z; ?- {, G0 }4 v" _" ~
因为样品已经没有了，只是还有cDNA样品，想顺便检测下细胞的凋亡情况，所以就定了几条引物跑了个qPCR
' Q( V, ^$ C% q& W& l8 S3 v- ^结果如下图( L7 W2 K1 g/ R
B组是对照，三个处理组，分别是D组、F组和H组，3d和5d两个时间点$ P) _2 N6 X" `. X$ s# a

2012-7-17 23:37 上传

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4 I# S+ ~1 N, m
这张图片能不能说明一些凋亡情况的？
9 s% m3 c3 |) K或者需要做哪些基因才比较好？
  {+ O" M. _4 u7 M期待大侠的意见，非常感谢！

yuhaoze

Fas是受体吗？ CD95R？
: d* {6 ^+ T1 ]2 d4 Y- M$ ~& ?( M8 N* e我看其他三种都是信号通路下游的一些凋亡因子，可不可以检测caspase呢？
- T) @7 c5 [# ~) }5 D5 n& B1 ~不知道你研究的是那一块儿，但要是想检测凋亡的话，通常情况下是western检测活性的caspase8/10/3/9等等
! s  v8 W1 r( B( [5 Q8 {

希望之光

凋亡相关的基因有很多，首先你选择的这几个是不是和你的实验目的相关，单凭图中的数据来讲，并未发生凋亡，或者说个别的根本就没凋亡。再看看相对表达量也不高所以呢建议楼主再仔细琢磨一下

妖妖空

我们可以好好交流一下的，我最近在做的是过氧化氢诱导的HL-60细胞的细胞凋亡的实验，也是第一次做这方面的实验，昨天96孔的板刚刚给药，今天先大致检查一下细胞形态，做下荧光染色，看下凋亡小体等的情况，做个DNA电泳，看下DNALadder。最后检测一些较明显凋亡细胞的细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸（ps）的含量，请问这样做初步筛选来确定能引起凋亡的浓度范围，行不行。谢谢指导。

妖妖空

回复 yuhaoze 的帖子
: I' H, C( H9 I- v
6 `; o+ x" t' L一般检测caspase的时候，起始caspase和效应caspase都要检测吗？通过特殊的caspase检测能确定凋亡是内源途径还是外源途径吗？

妖妖空

回复 yuhaoze 的帖子
! J& J- R/ @7 h+ e3 d$ T
0 p$ ~9 w4 p( d( ]+ B# D3 }3 W( SFas是外源途径中的受体，它的配体是Fasl。Bcl2家族对凋亡有抑制作用，其他两个蛋白家族对凋亡都是促进作用。

yuhaoze

: h- ]8 Q! x! e- T0 g
' \# h, [1 Z& o7 D" u. D检测那三个是一个anti两个pro，如果检测受体的话你就默认了那是fas外源性通路，但是外源性通路受体至少有4个。我这里有三个想法：5 @8 _- S; s. }! a, E
1.这个要看哪个快，一般如果在凋亡一开始就能检测到大量活性的caspase8/10，而细胞色素C和caspase3滞后的话，那很可能就是外源性途径。通常的作法也就是检测3个 caspase 8、10、3， 再多了也没有意义。! G9 O3 C' R( u' T
2.个人认为（因为有将近1年内有看这方面文献了），外源性通路和内源性通路的差别在于，capsase3和capsase8/10, 哪个是上游，哪个是下游。如果激活外源性通路，capsase3是下游，如果内源性通路caspase8是下游，我只是说一般情况，现在研究出了capsase12通路等等，就不在这个探讨的范围之内了。* M+ k: m# ?- ^) K) N" n
根据这个判断，你可以用特异性的capsase抑制剂，来抑制其中一个，看看另一个的激活状态是否改变。举个例子，如果你抑制了caspase8,发现caspase3从大量激活状态变成了没有火星的状态，那就可以证明caspase3是下游。: u3 |2 ~. o; ]$ a' ~; \- U
3.有一个连接受体和外源性起始caspase的蛋白,FADD,在各种外源性通路中都有参与，也可以检测这个。
& ?: P/ j! J* R8 v. H4 ^2 {7 e
/ P. {& r( {. W) ^! g& D' B! Q/ C  P& d/ G) v. i! t3 W, l
' d  \0 U) |# u4 h5 x' |, R9 m
我写过一个英文的东西，可以传给，你不知道会不会对你的想法有帮助

yuhaoze

检测磷脂酰丝氨酸这一步必须要做吗？我觉得很贵，而且你前面几步已经能够说明问题了，可以直接进入通路研究了

jiojoo

回复 yuhaoze 的帖子$ {# B* q/ d$ }& z( {7 ^  J

$ ^# g- Z  b* z感谢回复，因为我并不是做凋亡这一块的，凋亡相关的东东完全不懂。
- [! m3 [7 K0 H% V% x我只是看到其中一个组细胞7d之后都死光了，所以就想看下是因为坏死还是凋亡，另外，因为现在的样品还有cDNA，所以就只是想做个初步的实验来大概地判断一下" Z* `6 }$ }" N
Fas在NCBI上的描述是Mus musculus Fas (TNF receptor superfamily member 6) (Fas), transcript variant 1, mRNA
( N8 ~; j* l+ w: d% W1 u9 ^4 ^NCBI Reference Sequence: NM_007987.27 _! q2 a( [/ o; c+ I

2 k3 Z; i+ a& G: w5 h" WBclx是Mus musculus BCL2-like 11 (apoptosis facilitator) (Bcl2l11), transcript variant 2, mRNA
& C, j/ g7 z8 G) z5 pNCBI Reference Sequence: NM_207681.2( a3 \1 U" K& {+ N$ y) L

. x, X9 H! r# z/ K- Y, [) I. o0 {Bcl2是Mus musculus B cell leukemia/lymphoma 2 (Bcl2), transcript variant 2, mRNA
) Z4 T$ f! B7 DNCBI Reference Sequence: NM_177410.2
4 \5 n9 o  v: B
% A' y9 H5 @' h0 f- ^1 I; g' j+ LBax是Mus musculus BCL2-associated X protein (Bax), mRNA
' e# A% c$ _7 t! N( l2 MNCBI Reference Sequence: NM_007527.3
0 Q3 D! Q6 X1 @- ]- M( d; z
6 H8 \$ N0 Q7 C另外，图中Bclx和Bax标反了，不好意思~0 n5 G; J" R( O/ U1 d" `  B! B4 a
所以，您能否提供一些更好的基因来检测是否有凋亡的迹象呢？( d- x7 n4 M. X3 M; w" y( ]

jiojoo

回复 希望之光 的帖子# k2 ~! O- l5 Q3 P' B

7 x- p. h! v% M# Q  x; Q% z感谢回复，因为我并不是做凋亡这一块的，凋亡相关的东东完全不懂。+ ]  K( `! Z0 z+ w' Y3 ?7 `- ^+ ]
我只是看到其中一个组细胞7d之后都死光了，所以就想看下是因为坏死还是凋亡，另外，因为现在的样品还有cDNA，所以就只是想做个初步的实验来大概地判断一下9 M; ~" ?3 C$ G/ Y1 a
另外，图中Bclx和Bax标反了，不好意思~" n1 ^4 i; H, |' n4 V; f
另外，您能否提供一些更好的基因来检测是否有凋亡的迹象呢？9 o4 |; D/ {0 ]' V+ l2 o' ^