怎么通过基因表达来检测细胞凋亡？Fas和Bcl2，bax，BclX能不能检测？

jiojoo

( L: V) w2 q  c' B/ L

% c( |% F! s* ?5 r( U因为样品已经没有了，只是还有cDNA样品，想顺便检测下细胞的凋亡情况，所以就定了几条引物跑了个qPCR
: J. {0 O6 G0 `/ G! H. w# y结果如下图
+ J" ^: a0 ]6 V% d6 {B组是对照，三个处理组，分别是D组、F组和H组，3d和5d两个时间点
. X( ]' r! a1 T4 T3 ~

2012-7-17 23:37 上传

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. E2 v9 K  r3 `1 y/ i5 F这张图片能不能说明一些凋亡情况的？* Z' S8 t- k- _1 [" y" |5 |5 L+ W1 T
或者需要做哪些基因才比较好？, i- @+ B) d" y8 Z
期待大侠的意见，非常感谢！

yuhaoze

Fas是受体吗？ CD95R？/ n! U3 o4 `: q6 z
我看其他三种都是信号通路下游的一些凋亡因子，可不可以检测caspase呢？
/ Y3 ^7 c* R' Z2 H不知道你研究的是那一块儿，但要是想检测凋亡的话，通常情况下是western检测活性的caspase8/10/3/9等等
$ k7 r: }( z: I

希望之光

凋亡相关的基因有很多，首先你选择的这几个是不是和你的实验目的相关，单凭图中的数据来讲，并未发生凋亡，或者说个别的根本就没凋亡。再看看相对表达量也不高所以呢建议楼主再仔细琢磨一下

妖妖空

我们可以好好交流一下的，我最近在做的是过氧化氢诱导的HL-60细胞的细胞凋亡的实验，也是第一次做这方面的实验，昨天96孔的板刚刚给药，今天先大致检查一下细胞形态，做下荧光染色，看下凋亡小体等的情况，做个DNA电泳，看下DNALadder。最后检测一些较明显凋亡细胞的细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸（ps）的含量，请问这样做初步筛选来确定能引起凋亡的浓度范围，行不行。谢谢指导。

妖妖空

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; ?. }) T5 _1 U/ G# H3 s7 v0 ~5 j$ E! [) k
一般检测caspase的时候，起始caspase和效应caspase都要检测吗？通过特殊的caspase检测能确定凋亡是内源途径还是外源途径吗？

妖妖空

回复 yuhaoze 的帖子' p; Z  H9 G5 D  {  @' @. G
/ {' U. B- K% j# s
Fas是外源途径中的受体，它的配体是Fasl。Bcl2家族对凋亡有抑制作用，其他两个蛋白家族对凋亡都是促进作用。

yuhaoze

$ K1 x4 }1 j7 @" C! R/ e- y
/ x* p5 c. t+ p- ?  D2 o检测那三个是一个anti两个pro，如果检测受体的话你就默认了那是fas外源性通路，但是外源性通路受体至少有4个。我这里有三个想法：) R4 J" J( f1 R2 p* P( k( m% m% O
1.这个要看哪个快，一般如果在凋亡一开始就能检测到大量活性的caspase8/10，而细胞色素C和caspase3滞后的话，那很可能就是外源性途径。通常的作法也就是检测3个 caspase 8、10、3， 再多了也没有意义。/ B1 ?- v% h* m1 U  b) R
2.个人认为（因为有将近1年内有看这方面文献了），外源性通路和内源性通路的差别在于，capsase3和capsase8/10, 哪个是上游，哪个是下游。如果激活外源性通路，capsase3是下游，如果内源性通路caspase8是下游，我只是说一般情况，现在研究出了capsase12通路等等，就不在这个探讨的范围之内了。
1 m3 A' |. v0 F  T根据这个判断，你可以用特异性的capsase抑制剂，来抑制其中一个，看看另一个的激活状态是否改变。举个例子，如果你抑制了caspase8,发现caspase3从大量激活状态变成了没有火星的状态，那就可以证明caspase3是下游。' a" S* J  F' M7 i4 H9 i; i7 n
3.有一个连接受体和外源性起始caspase的蛋白,FADD,在各种外源性通路中都有参与，也可以检测这个。
; w7 ?0 |6 C3 i0 {3 p% f: o, H* V) u# Y* r% G6 W9 _8 S$ i  ]/ D, ?
$ F  K/ c1 T, j) b% O" h  ]# l

6 O6 S7 ^4 B) A- s( l" v) G( q我写过一个英文的东西，可以传给，你不知道会不会对你的想法有帮助

yuhaoze

检测磷脂酰丝氨酸这一步必须要做吗？我觉得很贵，而且你前面几步已经能够说明问题了，可以直接进入通路研究了

jiojoo

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* V1 U; Z/ ~8 ]7 `5 j1 S' t4 [; ^3 A" O
感谢回复，因为我并不是做凋亡这一块的，凋亡相关的东东完全不懂。
& K3 j! w+ U5 I/ n8 v5 v- N: t: C6 |8 W我只是看到其中一个组细胞7d之后都死光了，所以就想看下是因为坏死还是凋亡，另外，因为现在的样品还有cDNA，所以就只是想做个初步的实验来大概地判断一下* J7 u3 I' g2 ]' x$ M
Fas在NCBI上的描述是Mus musculus Fas (TNF receptor superfamily member 6) (Fas), transcript variant 1, mRNA
- _$ W6 o& l1 Z8 W+ `0 oNCBI Reference Sequence: NM_007987.2
% a( m$ A4 m2 B7 u7 @. E' m* }
5 {% s* t- T$ R) VBclx是Mus musculus BCL2-like 11 (apoptosis facilitator) (Bcl2l11), transcript variant 2, mRNA
( Y& P& d, T  {- T. a/ P" y* eNCBI Reference Sequence: NM_207681.2
* z' C6 B; [" b/ a) L# n4 S- l2 G0 |# f* f9 h& `/ g
Bcl2是Mus musculus B cell leukemia/lymphoma 2 (Bcl2), transcript variant 2, mRNA7 b6 c3 h$ ^8 T; g/ _, n# q
NCBI Reference Sequence: NM_177410.2
( G% O: B+ i$ m& G$ d# b: R$ M  \5 h' Q: O$ g9 N
Bax是Mus musculus BCL2-associated X protein (Bax), mRNA2 Q" Y! x, s( [" R
NCBI Reference Sequence: NM_007527.3; _  g; H% p4 E% p" r# Z$ w* i0 a
0 ?+ e" Z0 L5 }' C8 o- P; ?
另外，图中Bclx和Bax标反了，不好意思~
! h" A: j4 w% k+ {( E# H所以，您能否提供一些更好的基因来检测是否有凋亡的迹象呢？
; r3 T9 j. e3 C8 u# T

jiojoo

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/ `8 \$ v/ I" f# L5 W( L4 q
( P; y2 ~/ }3 e; O感谢回复，因为我并不是做凋亡这一块的，凋亡相关的东东完全不懂。( Q8 \% J1 P5 P+ A5 E
我只是看到其中一个组细胞7d之后都死光了，所以就想看下是因为坏死还是凋亡，另外，因为现在的样品还有cDNA，所以就只是想做个初步的实验来大概地判断一下
9 m* ~& g8 ^" g, Z, J; ]6 f/ x( }; Z另外，图中Bclx和Bax标反了，不好意思~7 K' c! J2 c. }3 @* X2 X: x" ]
另外，您能否提供一些更好的基因来检测是否有凋亡的迹象呢？  Z. A5 o4 Q8 m8 ?. M, R& c1 I