骨髓间充质干细胞相关问题讨论

wcforever126

小弟最近再做病人骨髓间充质干细胞培养，看了一些资料，分享一下& B7 `# D3 ^% [7 R
1、骨髓间充质干细胞在骨髓中含量很少，大概10的6次方骨髓单个核细胞中仅含有2-5个MSCs，故接种密度一般要在10的6次方；: E. b0 Y! T% D3 B" x9 j* k! p3 n
2、MSCs三天后明显看到贴壁，48小时有贴壁，7天可看到很多梭形细胞；
8 K9 v( j- v7 `9 q, [3、液体培养基中的L-谷氨酰胺在你打开培养瓶盖时候大概2周会代谢消失，所以要记得2周用不完要添加; E- t2 m$ P2 e3 K; R
4、血清一定要分装，不能一整瓶今天化了，明天再冻；
, h, a9 U9 }7 {$ ]# \. L5、配好的培养基一定两周内用完，2-8度保存。& w8 ]% S2 W4 T* W
各位高手给些意见，及你实验过程中注意事项。

wcforever126

人气不高啊，看完整个帖子，基本没发现关于人骨髓间充质干细胞方面的，故发此贴。

wcforever126

小弟刚开始做，可能好多写的东西不对，望各位前辈指证。
4 N1 P# v% A4 @  F首先从分离细胞说起吧，
* c( @) Z, U8 V我们实验室主要用F-P 1.077分离骨髓间充质干细胞，主要步骤如下，, o3 H& c1 Q* e" y: v$ L9 u" Z6 z( Y
1、骨刺5ml病人骨髓液，等比例PBS混匀；
% @7 b3 E6 T4 H( ~9 L: j5 d: F2、F-P比稀释后骨髓液1:1或1:2，一定要小心% Q+ Q3 l! g/ \" @( {- N
3、800g。20分钟，20度
$ Z/ r4 f: f9 v/ G% B4、白膜层，稀释3倍体积的F-P体积" P' Q/ f. B/ W2 G
5、300g,10分钟，4度，重复一次
+ [9 z6 W! ]" k. @6、接种密度5*10的6次方。

wcforever126

今天说下无菌观念吧. h+ H& t+ @1 [: l/ S
1、进实验室要换鞋，洗手，尽管您要戴手套也要洗手，穿工作衣，最好穿长裤到脚跟；
" f/ [& [/ m! d7 v2、打开超净台紫外灯30-60分钟消毒，这段时间可以把分离液及培养基从4度冰箱拿出放置室温，30-60分钟后基本上恢复室温，不用再在水浴锅里预热，防止不必要的污染。通风10分钟即可开始实验。
( a; b; J0 ~' G6 _1 v2 T" I4 D7 x3、酒精消毒超净台面，外拿进来的物品酒精喷洒消毒，至于是否点酒精灯的问题，保留个人意见。
6 {* z: X' @% @9 u' W0 O, Q4、操作过程中，不要混用枪头，最好自己的枪头前一天消毒，实验室人多混杂，注意保护。

wcforever126

关于接种密度问题
$ k- ^. F* f9 h0 z. g( r5 d! Q1、如果你用了细胞因子之类的，可以10的5次方/ml接种
' z% b8 @7 r, n! \  v! X" N2、如果没加细胞因子，可以10的6次方接种。

ffkkk2007

楼主精神可嘉，我也说一个：间充质干细胞培养应当使用树脂培养瓶，比用玻璃培养瓶的效果好很多

wcforever126

回复 ffkkk2007 的帖子2 N% F4 Y7 q( |' e0 g- Z0 f4 F
! e& |1 \6 G2 w
有利于贴壁，最好用进口的。

firstaider

从安全性角度出发BM-MSC我个人认为前景更好，当然必须是自体的，通过体外扩增的，目前体外扩增的技术都不怎么好，希望有人有更好的建议

lindanmiaoyao

你们都是做人的BM-MSC吗？有没有做猴子的？

细胞海洋

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