PBMC提取已经摸索好了，准备摸索CIK，麻烦懂的人进来看一下，万分感谢。。。。。.。。

113305060

前段时间一直在摸索PBMC，基本上已经摸索好了，现在准备开始做CIK了，但仍有几个问题不明，请知道的朋友解答一下，万分感激，呵呵！
" {; a8 U2 `" w+ K# _1.PBMC提取完之后，我准备放到直径为100mm的细胞培养皿中培养，问题是PBMC的量是多少，我在文献中看到的是1x10 6/ml，那一开始加10ML培养基的话，那就要1x10 7的细胞，是否比较多了？？？6 z( o( S9 z$ c% V1 m9 H1 ]2 W9 j
2.培养CIK一般利用什么培养工具培养？如果我一开始用直径为100mm的细胞培养皿，养到多少天后换成培养瓶（还是培养袋？），用什么规格的培养瓶或者培养袋？？？换液和传代的时候是否要离心？
4 e1 ], v1 S: _% S2 F0 b4 C% r5 S3.我采用的方法是于当天加入rh IFN-r 1000U/ml（请问是提取完PBMC立马加入，还是PBMC培养了2H吸取上清后加入），放置5%CO2、37oC孵箱中培养24h后，加入CD3 mAb 50ng/ml、及rhIL-2 1000U/ml继续培养，每3d换液并补充rh IL-2，培养至第14、15天，终细胞数为2x10 9-3x10 9。不知道这种方法是否可行，还是现在还有什么更好的方法，望赐教。
/ B1 [! A' ?) V+ y. X; P1 t6 m4.CIK培养完成后，一般是用什么方法检测，看的比较多的是流式细胞检测CD3，CD4，CD8，CD56，这种检测方法是否能够说明问题？？？2 @/ a8 z+ n& U/ p' q0 O3 `
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问题比较多，问的也比较乱，望大神能针对我的问题解答一下，谢谢！我的QQ是113305060。

liutianhua

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3 f. Y# m( t6 I" d( C9 w2 P, b' t. p& s6 c" G
分出来血浆之后在稀释血细胞，在进行密度梯度离心那步。

113305060

回复 liutianhua 的帖子7 M6 ^/ L/ S  l6 e

% N. }4 _/ O8 |6 y% x  Y7 I谢谢您的答复，我再想问一下你们血拿回来之后先离心一遍，将血浆和血细胞离心，然后再将血细胞稀释淋巴液再离心，再离心前血细胞是取血浆和红细胞中间的白细胞层，还是取除了血浆外的所有细胞层（包括红细胞）？谢谢

liutianhua

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% \  R/ B; `# M( k% @4 \" d, I
$ q; O+ }& I+ P5 s. `9 g  X血浆是为了培养细胞的时候用，这是自体血浆，这样在临床上才不会有问题。当然，用之前要灭活

113305060

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0 F" r# m7 C3 `9 ]7 ~* F8 E8 v1 ~
  V6 R/ ^% {& f3 \+ j) R2 N- S& y  T我也看过类似文献，但他们是先离心一次，把血浆和红细胞层间的白色层吸出来，然后再稀释密度离心。请问你们把血浆层也吸出来是什么原理，血浆层不是没有细胞吗，谢谢

liutianhua

回复 113305060 的帖子3 X* o+ |' C$ c' L: R0 ]. B( U

: `" g7 |& `* v# _6 Y$ S就是采完全血先不稀释，直接离心，上层就是血浆，下层是血细胞，然后把血浆吸出来，然后再稀释血细胞，密度梯度离心，大体是一样的，就是多一步离心。

113305060

回复 liutianhua 的帖子& b; [8 `. }5 [. [4 T

9 W# `/ E4 }( a8 i4 e我们采用的方法是采用淋巴细胞分离液分离抗凝全血，取白膜层，也就是提取PBMC。您提到的全血离心血浆，不知道是什么方法，能否详述一下，谢谢

liutianhua

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. L4 {2 J( Y' `6 C! C, o7 D2 G
. o: J; v5 m2 ]$ \临床是要用无血清培养基的，因为临床采血一般在50ml左右，离心下来自体血浆只有20-30ml，而临床上异体血浆是不允许的。
2 ?* l- |8 g- D我是用自己研制的，具体情况在给你的另一个回复里说了。
7 B1 a" D- m- H' n' s: t7 B; H0 fPS：临床的安全性没有问题，有医院检验科的第三方检验报告。

113305060

回复 liutianhua 的帖子! ~3 Y6 p' T) q+ m$ D

( k- I& q7 o: r  {9 C& R打算用1640培养基+10%FBS+0.5%双抗。打算先做研究，后做临床。临床是不是要用到无血清培养基，什么无血清培养基比较好？谢谢

liutianhua

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7 L: k) B* @1 v/ i
8 m! ~, H( t8 W2 P. o% o如果你第一天是这么算的话那养成CIK在15-22天吧。CIK培养就是你就随着细胞增长随着添液就是，还有你是打算用的什么培养基？是做临床还是做研究？