关于mES N2B27 feeder-free serum-free培养

vegetax4132

: Q; [& t' d8 x

7 X9 Q! S4 w5 A' \最近想建立mES的 feeder-free serum-free的培养体系
0 \" ?" a- b3 g$ H结果发现细胞传入N2B27培养基中大量不贴壁。但克隆球都是活的，再移到feeder上也都能长起来。$ }. |6 e- B) o: _
大家有遇到过这种问题吗？
# y# A% V! t5 s1 L- L- V; f- w
2 Z# R! O; f; s$ J我用的培养基:9 z. u. ^7 d. t$ z( f1 y
N2B27+LIF+2I+β-巯基乙醇+Glutamax+双抗      
/ O1 B+ [: u& }  j; _看YING QL 06年的那篇protocol中没加非必须氨基酸和丙酮酸钠，我也就没加。
$ A" _8 m/ z/ f9 k
1 z+ o, T* U8 E( m5 T! P在N2B27中， 图中圆圆的小球基本都没贴壁：3 u; r& C7 x- N7 K, i+ H

2012-8-8 21:45 上传

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( a, U& f  b2 w! ]/ `8 D
将图中小球移入feeder  血清中，就都贴壁了：" p# \1 v3 D" F" M" v5 N; B

2012-8-8 21:41 上传

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labghost

回复 zmm 的帖子0 f; u" X4 E" ]5 H% t8 B
  m, Q! `* L0 `/ W1 _( D0 j
这血清有没有谁试过用HSA代替呢？

sunnyhuan0629

如果真的是feeder-free的培养的话，建议先铺一层matrigel的，这样克隆团才会贴壁生长。另外，培养基的话，我们使用mTeSR1和PSGro都没有问题的啊~

坏蛋蛋阿布

用无血清培养加血清铺皿会不会有很多血清中不知明的东西上去了，有没有试过gelatin铺皿过夜

vegetax4132

回复 wbj1983 的帖子
2 F; [- Z2 x& V  E9 i
; g) l  w1 ?+ Z) S( x/ {' w十分感谢，我最近也把NEAA加上了，我发现用100%的FBS包被板子效果很好。

wbj1983

回复 vegetax4132 的帖子7 k$ |' M5 Q4 E4 @( {% w
9 n. Y1 |. j. V2 L( `
“N2B27+LIF+2I+β-巯基乙醇+Glutamax+双抗”这个培养基是没问题，试着可以加一下NEAA，我是这么做的。还有培养皿一定选择贴壁效果最好的那种corning的（这也是我自己用的）。铺0.1%的明胶37℃20-30min，我们培养的贴壁效果挺好，根本不用需要matrigel，matrigel相对来说还是很贵的。还有希望您尽量用进口的ES medium所有组分，国产的在这方面还是欠佳（不过我觉得您也肯定用的进口的）。还有，您冻存ES的时候可以用90%FBS+10%DMSO效果可能会好一些。纯属个人建议，我是这么做的效果不错，来这儿和大家分享一下，希望对你们的实验有所帮助！

zpzp0312

回复 vegetax4132 的帖子
7 i/ s% X2 ]0 m5 I2 S5 q! O- A$ j$ {' ?& y# }
我回帖的主要意思是matrigel不一定适合细胞贴壁8 |! F% c. i) n$ B( H
虽然有这样的报道$ F) [/ A7 ], ~7 I9 y& t0 D
毕竟matrigel比较贵，如果有其他解决方法就没必要花那么多钱买matrigel去试验

zmm

回复 vegetax4132 的帖子- [) d8 W7 g- S) I7 y) A

0 ?  X( d2 {0 Z0 s! |血清也可以。因为不含血清，所以克隆增殖较慢

vegetax4132

回复 zpzp0312 的帖子
; e% |9 O- v5 {  h  X9 X% }: _5 N
' E1 I! g& |+ T$ P, h* u1 T/ J谢谢，    不过ESGRO也是一种类似N2B27的培养基吗？      
  v3 t3 _2 T' j2 O. C我用N2B27+LIF 加上feeder，  发现克隆形态不好，feeder有大量死亡   

vegetax4132

回复 zmm 的帖子
; H4 d; ?" ?  Z' i
- @6 r- ]3 d1 ?. ~7 [1 M4 ^我是铺了明胶的，
" g5 Y* |- T  ~1 F最近听说再铺一层血清就能贴壁了，试了下真的基本都贴了，不过这样克隆长的很慢了。好几天天都不见长大。。。