关于mES N2B27 feeder-free serum-free培养

vegetax4132

0 s8 w: I& y+ Y( r9 S( A- A. C1 \9 x1 s- l# p- V* l# _) g5 E" ]
最近想建立mES的 feeder-free serum-free的培养体系
% \1 w# v- z9 H结果发现细胞传入N2B27培养基中大量不贴壁。但克隆球都是活的，再移到feeder上也都能长起来。
" X& ?' [/ h7 a+ v9 U( L5 [# f( ]大家有遇到过这种问题吗？
9 T1 t4 j- X, S2 y: h/ I  b7 J+ A( }% ~( d5 U
我用的培养基:
# u8 |1 _, V5 y5 X2 Y) J- HN2B27+LIF+2I+β-巯基乙醇+Glutamax+双抗      
) y9 _) b' I1 P( h3 P; T# }看YING QL 06年的那篇protocol中没加非必须氨基酸和丙酮酸钠，我也就没加。: O% k7 M7 g6 o  b1 A- _* _9 M0 @5 f
9 U5 E. w3 c) F* L$ [3 m2 [
在N2B27中， 图中圆圆的小球基本都没贴壁：
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2012-8-8 21:45 上传

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* D/ G! I9 w6 p$ C8 \! |
将图中小球移入feeder  血清中，就都贴壁了：
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2012-8-8 21:41 上传

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zmm

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0 g& w: e6 I, S7 `5 s" n  E5 ^  k
9 w3 f# l- _, T* P& @- r你需铺些基质，克隆就会贴壁了。

vegetax4132

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2 R; s+ c2 w' g! _" C' h7 p. m# p5 _6 @# N
基质？  是什么啊？   

frankieisme

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3 K9 h0 p9 o- F+ b0 H有一种"matrigel"

vegetax4132

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8 z% C0 z6 Y7 [. f; X7 [* l
% M4 \' I. \1 ]/ c/ B- t哦      是一种比明胶更好的胶吧？   听说过   4℃铺  37℃会凝固   是这种吗？

zpzp0312

0 D- `2 S) r5 }, J% V% q9 W

2 ^$ B# A, ?5 l9 Z* W9 p其实你这种转移到饲养层上的细胞球也已经有分化倾向了3 ~+ G! f2 X& Y6 J0 M* i' P9 m
另外，matrigel我们使用过，只能说效果不明显
1 S: Y7 e7 j% ~/ @- n7 ~6 t当时我们使用的是ESGRO feederfree medium
& l$ g+ B/ ^9 E效果和楼主的这两张图相似
* M, ]  a, _; J  d/ y在matrigel上面也不能很好贴壁，有大量的细胞球似乎和基质有些黏连，但适当晃动就会飘起来1 s$ \9 v' Z1 F* Z0 X' Y) t6 |1 n
转移到饲养层，就可以发生贴壁，但是也有分化倾向
# U" i2 x" F6 V  F/ y  x5 M6 q/ T" U但如果直接使用饲养层培养添加这个培养基，细胞生长状态还是不错的) _; t) W' r( }! U% Y5 ]' H
feederfree效果不满意

zmm

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7 w* C: R; k* K6 Q
明胶等都可以

vegetax4132

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7 O) P" l/ P+ g: o/ Z
- |, c7 E0 f: Y8 }% K我是铺了明胶的，
+ ?' G- E4 o3 V7 w2 C2 a最近听说再铺一层血清就能贴壁了，试了下真的基本都贴了，不过这样克隆长的很慢了。好几天天都不见长大。。。

vegetax4132

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) G8 I$ S: B9 y( Q+ b& u$ g+ m
- E# D5 _. q1 v, Q+ y; f( L- T谢谢，    不过ESGRO也是一种类似N2B27的培养基吗？      0 D" B0 ?# N3 d/ G4 u/ L0 n- Z2 N
我用N2B27+LIF 加上feeder，  发现克隆形态不好，feeder有大量死亡   

zmm

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) Y9 f" m$ t" p" }2 x# W血清也可以。因为不含血清，所以克隆增殖较慢