关于mES N2B27 feeder-free serum-free培养

vegetax4132

7 Z- |( ?7 _1 Q3 }1 L0 }
* i( u, s. r5 q8 O# J) M最近想建立mES的 feeder-free serum-free的培养体系
8 e2 Z/ i9 d% q3 t* @/ q  R* \) l结果发现细胞传入N2B27培养基中大量不贴壁。但克隆球都是活的，再移到feeder上也都能长起来。
& J/ v: o  Y; E0 r, ?大家有遇到过这种问题吗？( _5 x; ~! v! _7 z6 ?# {

/ Y4 s6 X( m& s1 w0 O( @& [. [* _我用的培养基:
1 {8 a) G6 J- R/ bN2B27+LIF+2I+β-巯基乙醇+Glutamax+双抗      ( ?, p' \9 v6 S/ x5 F& `5 X
看YING QL 06年的那篇protocol中没加非必须氨基酸和丙酮酸钠，我也就没加。
) r( I2 z4 N" h0 k' p+ ^" n& M6 A# Q4 X5 j" t9 B6 b/ h  I1 t
在N2B27中， 图中圆圆的小球基本都没贴壁：
+ X& U1 u5 E; }) R* [& f$ D

2012-8-8 21:45 上传

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5 r  B. ?  G, \& b
将图中小球移入feeder  血清中，就都贴壁了：
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2012-8-8 21:41 上传

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labghost

回复 zmm 的帖子; W. Y8 [2 k) Z& `
. Q( _& r4 `5 u2 I# }! k
这血清有没有谁试过用HSA代替呢？

sunnyhuan0629

如果真的是feeder-free的培养的话，建议先铺一层matrigel的，这样克隆团才会贴壁生长。另外，培养基的话，我们使用mTeSR1和PSGro都没有问题的啊~

坏蛋蛋阿布

用无血清培养加血清铺皿会不会有很多血清中不知明的东西上去了，有没有试过gelatin铺皿过夜

vegetax4132

回复 wbj1983 的帖子3 _. a4 w4 H+ I& P  A, E, ~) |
% l& _. J2 ^: i, P- W
十分感谢，我最近也把NEAA加上了，我发现用100%的FBS包被板子效果很好。

wbj1983

回复 vegetax4132 的帖子
. w8 [8 h- W+ E) `8 g
% C! L! d0 p- v“N2B27+LIF+2I+β-巯基乙醇+Glutamax+双抗”这个培养基是没问题，试着可以加一下NEAA，我是这么做的。还有培养皿一定选择贴壁效果最好的那种corning的（这也是我自己用的）。铺0.1%的明胶37℃20-30min，我们培养的贴壁效果挺好，根本不用需要matrigel，matrigel相对来说还是很贵的。还有希望您尽量用进口的ES medium所有组分，国产的在这方面还是欠佳（不过我觉得您也肯定用的进口的）。还有，您冻存ES的时候可以用90%FBS+10%DMSO效果可能会好一些。纯属个人建议，我是这么做的效果不错，来这儿和大家分享一下，希望对你们的实验有所帮助！

zpzp0312

回复 vegetax4132 的帖子7 E, f+ M: X- l) z4 T4 E; n% q' |  k
9 }" i0 H# t. o" t: {
我回帖的主要意思是matrigel不一定适合细胞贴壁1 s. |9 b. t4 @$ [" e8 \/ ?
虽然有这样的报道
( y% y0 G2 I& y毕竟matrigel比较贵，如果有其他解决方法就没必要花那么多钱买matrigel去试验

zmm

回复 vegetax4132 的帖子; E0 K' X( j# q2 q

& U5 d/ _6 u' `1 S血清也可以。因为不含血清，所以克隆增殖较慢

vegetax4132

回复 zpzp0312 的帖子& F3 \1 ^) X! h: I
9 M" s$ d3 B* ?. I+ k) }; y1 k! c
谢谢，    不过ESGRO也是一种类似N2B27的培养基吗？      
8 k  t4 p9 S$ _$ t我用N2B27+LIF 加上feeder，  发现克隆形态不好，feeder有大量死亡   

vegetax4132

回复 zmm 的帖子9 d4 X: P7 ~! _6 q2 o( n2 d

. N% ^5 V3 l' ^1 p; q- p% H我是铺了明胶的，( d$ L( z& L( V+ i! z' Z8 u  [" \
最近听说再铺一层血清就能贴壁了，试了下真的基本都贴了，不过这样克隆长的很慢了。好几天天都不见长大。。。