有养过RAW264.7的高手吗？

一转身的距离

如题，请教，为什么细胞冻存后复苏不贴壁？是不是RAW264.7对胰酶的作用很敏感？但是为什么在培养时又会觉得很难消化？
- u7 k% T2 |& E才养这株细胞，急求解答！

crystal_xjw

我也没养过，但是对这个问题好奇。复苏后不贴壁？难道细胞的性质有了变化？还是您在消化的时候酶太多了，细胞损伤了，已经死了，或许是这样。

myboluo

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如果是传代消化时不贴壁应该是你消化时间过久导致细胞损伤了，可要是复苏时不贴壁可能原因就多了，降温过快、复苏操作不正确都可能导致细胞大量死亡（看看不贴壁的细胞是否边界清晰、透明，否则是死细胞）。RAW264.7本身贴壁非常牢，可我同学养了一段时间后，也比较好消化了。她消化时先用胰酶消化不超过5min，含血清培养基终止消化，之后用刮刀刮。后来嫌刮刀会污染，就用手拍打培养瓶代替（拍有细胞的那一面），或者尽量用吸管吹，吹不下来的就舍弃不要。消化下来后还不贴壁，请耐心等待3~5天（实际上就是放孵箱不管了，千万不要时不时的看），小鼠巨噬细胞贴壁都很慢，原代培养时需要7天左右。

jimxia2011

RAW264.7不适合用胰酶消化，，建议你用预冷的PBS侵泡5-10分钟，然后用移液枪把细胞打下来。。这个细胞容易老化，，不要每次多冻存点，，不要传太多代

一转身的距离

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# B# M5 u$ x1 N+ b$ x9 m" @我们做了原代培养，2个小时后细胞就贴壁了，只是增殖就很慢了，贴壁后基本就不增殖了。这个问题我也一直很困惑~

一转身的距离

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% ~9 _( s! N8 g7 l) r5 k3 K看样子这个细胞在消化时胰酶的用量和消化的时间还有吹打的力度都很有讲究。

一转身的距离

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+ a, r" G# F6 b' a回复 myboluo 的帖子
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不知道是不是冻存前培养时间太短的原因，因为冻存前细胞状态很好。最开始我们也是复苏培养的，2天后就可以传代了，1比3传代后，第二天就能冻存了。不知道是不是传代和冻存之间的间隔时间太短？冻存前消化时我们的消化时间确实比较长，超过了10min。

一转身的距离

回复 jimxia2011 的帖子* Q2 L5 [5 c) U) v1 A) ]! m# d
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没有试过用预冷PBS浸泡，因为它贴壁牢，所以没想过可以用这种方法。可以试一下。

shy8610

raw264.7相对来说，还是比较容易复苏的，要求是冻存株当时是健康优秀的，复苏的时候，尽量选用进口一次性耗材，包括管子和移液管，培养基单独配，不与其他细胞混用，PBS的要求一样，我们实验室十分介意raw细胞是否受刺激，消化情况也可以看出细胞的状态，一般来说，37度消化2分半，就可以镜下看出细胞变圆，然后可以用拍打的方式将细胞拍下，绝对比等着胰酶效果好，另外注意防污染黑胶虫

一转身的距离

谢谢各位的建议与宝贵经验，很受启发！非常感谢！