问题请教我做的是小鼠胚胎干细胞的免疫荧光，想看加药后是否还能表达OCT-4

李夏

回复 jhu132llh 的帖子6 }* C% Q$ D  d( K& q) y
( e2 o6 g$ `. j) Q
非常感谢您的答复，我做免疫荧光检测的时候用的是96well，为了省抗体，具体步骤是这样的：3 L! _3 y5 P! I# [# A
吸出培养液，PBS洗涤两次8 ]/ U( Y  w) m: e& P: C
4%多聚甲醛固定hESC 5min
' Z% H% N% E9 d( N% h5 yPBS洗涤三次，每次5min) ]& m% Q$ v; v4 h
0.1%Trion-X100/PBS通透细胞膜5min,PBS洗两次& l8 c  L: ^+ P, J7 _+ T1 F: w
3%BSA/PBS室温下封闭1h& a! H- n3 _: p+ W& r
孵育一抗(Oct-4,SSEA),室温4h  W( E" D/ R! V/ D! P+ E: l
吸出一抗，PBS洗涤3次，每次5min
( |' T( K5 D$ o( e" \孵育二抗,室温1h" J# O6 g# `6 @4 ?( |: g$ ^2 C/ l: a
吸出二抗，PBS洗涤三次，每次5min: m$ ]4 J- j; ~
不知道这样做有没有什么地方不妥的，望您不吝赐教，非常感谢了

李夏

回复 fish_zbw1985 的帖子
  l$ L$ }) Q$ y% q$ p& ]$ G0 V+ G7 Y0 `7 ?
非常感谢您的答复，我做免疫荧光检测的时候用的是96well，为了省抗体，具体步骤是这样的：
! K2 g& ^9 Q6 M4 y1 I; E吸出培养液，PBS洗涤两次
3 V% ^: K) o5 C- D. u2 l. ~/ }4%多聚甲醛固定hESC 5min" S* S( O* X' o- u6 b. Z6 W& m
PBS洗涤三次，每次5min) N5 f. X4 R0 D
0.1%Trion-X100/PBS通透细胞膜5min,PBS洗两次
' u0 K7 r. x" [7 O  \& ?3 M! d3%BSA/PBS室温下封闭1h
  Y8 ]6 s+ L+ x9 w' b, X孵育一抗(Oct-4,SSEA),室温4h! ^) Z: }8 h# P* H. U/ b7 A# l# q
吸出一抗，PBS洗涤3次，每次5min
) W: k! N! |0 b% K. k% Z孵育二抗,室温1h
( I+ A* Z2 z. v! D  q吸出二抗，PBS洗涤三次，每次5min0 Z: k) c: z/ Q/ G7 S+ }  B
不知道这样做有没有什么地方不妥的，望您不吝赐教，非常感谢了

jhu132llh

1.DMSO也是可以过滤除菌的
1 z+ g5 k. {6 x; c8 q使用特殊的抗有机溶剂的滤器% s! w* A+ U! `2 u/ C1 \
很多公司有这样的滤器的，找试剂代理商咨询一下就可以了
; q) s$ o* L' c" L5 {" S2.ES的贴壁性还是可以的吧，你洗涤的时候动作轻柔一点，上摇床的时候转速慢一点，加洗涤液的时候从皿壁上贴壁慢慢加

fish_zbw1985

回复 李夏 的帖子
" |  L3 y- h/ a8 S7 _2 x/ o1 w( r9 E
回答你的两个问题:, [0 l  ~- {1 B3 e, t
1.细胞作免疫荧光掉下来多半可能是你没有把细胞用多聚甲醛完全固定住造成的- v% C8 r/ }% m" o
2.DMSO毒性较大溶解小分子化合物污染概率非常低,配置完成后也没有必要也没有办法过滤.