问题请教我做的是小鼠胚胎干细胞的免疫荧光，想看加药后是否还能表达OCT-4

李夏

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" j3 C4 P* O; J6 s/ b% u9 M. B我做的是小鼠胚胎干细胞的免疫荧光，想看加药后是否还能表达OCT-4，SSEA即是否还有自我更新能力，但是效果一直不好，主要问题细胞经过多次冲洗到最后观察时已经掉下来了，由于我的药物是DMSO配置的不能紫外消毒，所以有时经过四天孵育后，细胞就染菌了。。。。有没有人能指点一下啊    感激不尽啊

fish_zbw1985

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  |/ _3 A7 E5 Z! ?- |& g7 @
回答你的两个问题:
. f7 {* a, Q- O  v" t# ?& v1 @1.细胞作免疫荧光掉下来多半可能是你没有把细胞用多聚甲醛完全固定住造成的
+ F& V/ u9 a1 b) O, y; y2.DMSO毒性较大溶解小分子化合物污染概率非常低,配置完成后也没有必要也没有办法过滤.

jhu132llh

1.DMSO也是可以过滤除菌的
4 I' f, h2 q4 P! m3 Q使用特殊的抗有机溶剂的滤器
0 V7 D! g0 I, H9 M- F& o3 K- I很多公司有这样的滤器的，找试剂代理商咨询一下就可以了7 r8 X* E. d! ~$ ?
2.ES的贴壁性还是可以的吧，你洗涤的时候动作轻柔一点，上摇床的时候转速慢一点，加洗涤液的时候从皿壁上贴壁慢慢加

李夏

回复 fish_zbw1985 的帖子$ i0 k8 k; Q( ]! j1 w
# [# ]* E- R6 E# {+ n1 }) X$ c8 O' M
非常感谢您的答复，我做免疫荧光检测的时候用的是96well，为了省抗体，具体步骤是这样的：
. \! E7 b: V& [' X) G: N. D吸出培养液，PBS洗涤两次9 [  g& z" n7 f9 F) O1 ~
4%多聚甲醛固定hESC 5min
+ ]0 u! H( [$ c1 _  \5 GPBS洗涤三次，每次5min( F' u; g0 r! s0 o! |4 y+ {( g7 ?
0.1%Trion-X100/PBS通透细胞膜5min,PBS洗两次
; a2 L/ q  ^. b# `, j) w; I$ Q5 a3%BSA/PBS室温下封闭1h& \8 L4 Y1 a, h6 G! m5 M
孵育一抗(Oct-4,SSEA),室温4h$ d4 F7 |$ S9 t* |# Z
吸出一抗，PBS洗涤3次，每次5min  P+ R$ Y: i8 ~: w1 k. s4 b
孵育二抗,室温1h5 Q9 \( O; P, H1 ]+ d, G
吸出二抗，PBS洗涤三次，每次5min
1 D4 d/ u2 d& ~' `0 u! o不知道这样做有没有什么地方不妥的，望您不吝赐教，非常感谢了

李夏

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1 g, u9 ~! e% H/ v) f) Q0 ?4 v7 h
非常感谢您的答复，我做免疫荧光检测的时候用的是96well，为了省抗体，具体步骤是这样的：
( }( n8 p5 ?0 D! d- w& u' ~& }吸出培养液，PBS洗涤两次# X) C4 L3 W5 P% D' M
4%多聚甲醛固定hESC 5min
8 Q$ u) O1 w  S/ K' y6 ZPBS洗涤三次，每次5min
: [  v6 v  Z3 m, M& Z0.1%Trion-X100/PBS通透细胞膜5min,PBS洗两次
9 S( d, [1 Z% r! i. i. X  T- f3%BSA/PBS室温下封闭1h
6 M. Y! f- ?' A/ c+ }- X. O孵育一抗(Oct-4,SSEA),室温4h3 t- }+ _+ \5 I! i' R6 S  e
吸出一抗，PBS洗涤3次，每次5min
) q4 L+ u& C+ X" I. {孵育二抗,室温1h
/ f9 N: c  c% u& e" m* X: B; x8 L吸出二抗，PBS洗涤三次，每次5min
9 i8 |1 c% `  w不知道这样做有没有什么地方不妥的，望您不吝赐教，非常感谢了

jhu132llh

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& K8 e& J# q# x* F$ _9 l, }" l- ?7 u
方法看起来是没问题的. B3 O- x7 z$ H% d- I/ X3 ?$ H6 c
可是你说的省抗体我倒是没看出来8 ], \0 u, y8 f$ x* |. j
我们做的细胞的爬片然后在做染色的时候只需要几滴抗体就可以了

fish_zbw1985

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' p- s. O+ J: f
固定时间不够 用96孔板确实不好操作  特别是ES细胞都是成克隆样的  个人觉得至少需要用48孔板

chenks

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# f$ f+ Q# Q8 U0 M& a; X- ^# s/ X$ [
固定时间可以延长一些到半小时.另外用24孔板后者48孔板,放入玻片也很省抗体的模拟可以试试./ Q4 g- ~0 d/ o; X, b
还有一个问题你的细胞有无Feeder;如果有Feeder的话,基本上细胞是不会掉的;如果无Feeder,就会掉很多细胞.

李夏

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# _7 B3 `! h8 ~2 X  I- x4 ?1 g: t( p& ?  h/ H$ u
非常感谢您的答复，我用的是无血清无feeder培养法，培养基为N2B27+LIF+MBP4，因为我养的细胞主要用来筛药，所以不能用血清和feeder，否则就说不清是我的药物的作用还是feeder成分的作用，所以细胞就不是很容易贴壁，而且传代两次细胞状态明显不行了，所以很是苦恼啊

白巧克力

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& a4 e/ l& J" @4 l  H( f  U/ p! u9 k6 v1 ^6 E8 S
我也是筛药的，不知道我们是不是很近...你一直用无feeder的，应该条件比较稳定了，其实可以考虑用CCM促进贴壁，只是要设个空白。