问题请教我做的是小鼠胚胎干细胞的免疫荧光，想看加药后是否还能表达OCT-4

李夏

( H+ {* Q  X7 o' H: _1 U
$ ~* b) H2 k' ^1 Z
我做的是小鼠胚胎干细胞的免疫荧光，想看加药后是否还能表达OCT-4，SSEA即是否还有自我更新能力，但是效果一直不好，主要问题细胞经过多次冲洗到最后观察时已经掉下来了，由于我的药物是DMSO配置的不能紫外消毒，所以有时经过四天孵育后，细胞就染菌了。。。。有没有人能指点一下啊    感激不尽啊

李夏

回复 fish_zbw1985 的帖子; C$ V2 O: l$ S4 `

( s0 d$ s9 {) V# A/ o' n2 \' _非常感谢您的答复，我做免疫荧光检测的时候用的是96well，为了省抗体，具体步骤是这样的：3 U! [8 L0 E% c( p9 G" [
吸出培养液，PBS洗涤两次  J+ u0 S' h+ F! u& r6 |, [. K
4%多聚甲醛固定hESC 5min
  q/ b& ], ~2 fPBS洗涤三次，每次5min6 f" k5 t+ A' b. F+ p) f
0.1%Trion-X100/PBS通透细胞膜5min,PBS洗两次2 |. a' \0 Z( B+ {
3%BSA/PBS室温下封闭1h
% Z) _" o6 R" @孵育一抗(Oct-4,SSEA),室温4h8 F% @9 @' C4 A* V6 r
吸出一抗，PBS洗涤3次，每次5min- _% j% A% B2 b: P
孵育二抗,室温1h" l+ y* l. U. R7 v, D
吸出二抗，PBS洗涤三次，每次5min& v6 r' T/ W; Q$ C
不知道这样做有没有什么地方不妥的，望您不吝赐教，非常感谢了

李夏

回复 jhu132llh 的帖子
, }2 S6 C) h8 S# Y- c/ t8 {" w0 q6 k* m' V# i- S# W4 X
非常感谢您的答复，我做免疫荧光检测的时候用的是96well，为了省抗体，具体步骤是这样的：
5 n' v9 J# u5 T! N* x. b吸出培养液，PBS洗涤两次9 N% f1 @  r( _8 R: I
4%多聚甲醛固定hESC 5min
8 s0 e+ f8 g* w5 jPBS洗涤三次，每次5min2 ?6 [) _3 g- v+ L
0.1%Trion-X100/PBS通透细胞膜5min,PBS洗两次
# S- Z8 K/ h) S  [7 m3 V- j- k3%BSA/PBS室温下封闭1h
: e9 E* Q; x  k/ r孵育一抗(Oct-4,SSEA),室温4h
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孵育二抗,室温1h8 O  l% z" m5 o" W. a, E
吸出二抗，PBS洗涤三次，每次5min
7 T2 x: Q' f5 s. Y不知道这样做有没有什么地方不妥的，望您不吝赐教，非常感谢了

李夏

回复 chenks 的帖子3 ]4 p( H, s2 x9 F& X" J

# Y$ M- G8 V% |: x) [非常感谢您的答复，我用的是无血清无feeder培养法，培养基为N2B27+LIF+MBP4，因为我养的细胞主要用来筛药，所以不能用血清和feeder，否则就说不清是我的药物的作用还是feeder成分的作用，所以细胞就不是很容易贴壁，而且传代两次细胞状态明显不行了，所以很是苦恼啊

李夏

回复 白巧克力 的帖子' I( B" C3 D6 y6 E) I; K
# v$ t  {3 j  A' K$ i2 w4 V
CCM是什么啊，我没有用过，能传授一下吗？其实我的条件不是很稳定，但没有办法，只能无feeder养来筛药。请问您是什么条件的培养基来筛药的呢？期待您的答复

李夏

回复 白巧克力 的帖子+ K2 O  P! S) u* v

. V/ h( z* C: B$ I" q7 n请问CCM具体是什么呢？我没有用过，想请教一下。3 ~7 B7 A  Q7 [2 J
其实我的应用条件不是很稳定，经常重新复苏细胞，但是由于筛药没有办法只能用无feeder培养。这里我很想知道您是用什么条件来培养细胞进行筛药的呢？期待您的答复

李夏

回复 chenks 的帖子$ `6 u; e' H" z8 ]3 b
8 p$ ?- D: s1 Z. b1 P+ S
想请教您大玻片是可以直接买到的吗，就是做免疫荧光专用的吗？是不是这样就可以不用铺明胶了啊？我之前都是先铺明胶再铺细胞的，期待您的答复，万分感谢！