关于慢病毒转染人脐带间充质干细胞的问题。polybrene、MOI值

quge_00

最近在做慢病毒转染脐带间充质。有做过的，请教一下。
) ]- \" `* }4 U7 Y0 T3 ?! M1、包装细胞接种第二天融合达50%，文献有报道到70%再转染，50%效率是不是高些呢？  u! v" y- ?- B) T2 w' j
2、为什么要用无双抗的培养液配制病毒液呢？- L) X$ z( w7 e# W+ Z
3、转染前用293细胞测滴度不？
/ ]. }! @6 g) O0 \4、文献报道MSC使用慢病毒转染MOI值比较高（10），并且同时还加入了polybrene（8ug/ml），请问您操作时加吗？还是自己梯度摸索呢？! `% }' v6 u1 O2 k( _4 {- g
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7 H% y: ]4 b; N- w6 z
问题很多，见谅啊~~很是头疼，因为做了一次，没有明显的转染阳性的。。。。

jhu132llh

1.50%和70%效率上差不多，到那时50%的更方便一些，因为慢病毒表达比较慢，一般是转染后2-3天才筛选的，所以50%的要好一点的；
0 R* G) g% n$ X6 D$ s7 E2.理论上，培养液含不含双抗和相应的生长因子对病毒是没有影响的；有的时候，慢病毒转染还是使用完全培养基的；
7 o, S* E9 d" ?' {3.一般在纯化慢病毒的时候就已经检测滴度了，所以一般是不用重新测滴度的，除非病毒在-80度冻存超过8个月，一旦冻存超过8个月，最好是重新做个滴度；
, w! n9 d% s0 A6 Z- R- a0 @+ y* g4.可以做个梯度MOI，所有人的MSCs都会有点差异的，所以条件不能完全通用，所以最好是做个MOI梯度摸索一下最佳条件；$ p, f* @, z/ M) V( L3 H2 Z- b% F
5.polybrene是一种带正电的小分子，可以有效中和细胞表面携带的负电荷，有效提高转染效率至10倍左右，可以试一下不加和加，然后加8ug/ml和6ug/ml两个条件；

chentian820

就我最近的经验分开解答。) s+ X( w' N9 `- t
1 293细胞密度在50-80%均可进行包装。包装效率最关键的还是包装细胞的种类和转染试剂，如果你的包装细胞用钙转不理想，建议你直接用lipo2000转；
0 c- e/ j( W' C" ]1 |! o2 我的培养基里面是加正常抗生素的1%。有的时候也不加抗生素。其实抗生素影响的主要是你的转染效率，而不是直接影响病毒的活性。
! X3 X# c3 j/ |: X5 N% d( r3 不用测滴度。测的滴度也是相对滴度。仅作为参考。
0 j& T: u* M% J* d1 ]4 我使用的polybrene浓度是10， 感染后12h换液。

quge_00

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多谢解惑啊~~~

quge_00

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1 y0 L# c% u% z1 h; Q8 A% V  t学习了啊~~