RNA电泳，求解

runsong

第一次做体外转录，加帽，没加尾。浓度1300ng/μl& f2 q, @2 W8 h
然后用1%的普通胶电泳。' l" E- e& q+ W# y0 u
根本木有注意电泳中RNA酶的问题，木有甲醛，啥都木有注意。
! d! ~- y1 x5 k- s) |# W' I跑成了这个弥散带3 ~9 |6 C; D1 k' q& E$ K; u. V0 n
想问：4 @) C3 A* {. t# P/ [9 d' g6 j7 m  s
1、标准的体外转录产物电泳加不加甲醛，是否用5%的胶影响大吗？$ [! @( A* E; P- [
2、我的片段是不是降解了？是电泳过程中的，还是本身就降解了？% T: ]5 m1 W+ I* v! }. K

7 K3 ?! k2 h7 G* Z! \2 r$ A7 w注：没有RNA marker，DNA marker 也没有，本人根据经验，产物大小若以DNA marker判断大概有1000-1500，我的目的片段应该是2000nt。

huangxf1998

你的应该是做出来了。
. @7 e% b( q+ E0 R/ I( L9 s1 Y5 ?只是你的照相水平有待提高，对焦啊！% S" V- M* Y# ?/ n8 J$ t/ M
) u' c; {% J/ C) b4 X( x
但是，侥幸跑出来不等于以后也会跑出来。楼上同行的话应该好好记住呀！

细胞海洋

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7 |9 j' P- n+ ^7 @' \你回复谁 就点击对方回复帖子中的回复按钮 然后输入内容 像我这样
- k- y( N# V! D1 j# `+ B' Q! w* G5 c/ U, E& {/ V0 Q: [
否则他会看不到

ying

回复 ying 的帖子7 W$ i! F; @3 ]! D* C, L
$ s* j8 S0 C" c  x) b( `
我个人觉得像。MMkit里面有阳性对照质粒的，你可以按照上面的trouble shooting做一下嘛。带上pos.ctr
& Z! o( h+ Q+ `4 l7 y我质粒线性化之后是要做PK消化和酚抽乙醇沉淀的。RNAsin只能干掉少量的RNAse，要是RNAse残留太多还是不行的。一般实验室RNAse主要来源就是小抽，你的枪最好洗一下。

weiyepan

RNA电泳跑1~3%琼脂糖TE电泳本身是没问题，问题是如果你用的是平时跑质粒的电泳槽和buffer的话，里面本身就很多Rnase（miniprep kit里面带的）。所以，想偷懒不做甲醛电泳的话，最好跑之前把槽洗干净，新胶换新的buffer跑。6 y& H; N* {) N! @
另外RNA是单链有2级结构的，如果不做变性电泳，是看不出准确大小的，而且本身RNA和DNA糖环分子量大小也不一样，我不知道你连marker都没点怎么样看出大小的。。。
; {( b2 ~! n  i- z

runsong

我将质粒模板酶切线性化之后用的，之后胶回收。" c# o+ ~# Z+ E( f6 R$ O4 P
盒子用的mMESSAGE mMACHINE Kit，里面有RNA酶抑制剂。5 V5 ?; s. S) E* b: I2 t- y
你的意思是我的样品RNA酶污染了吗？

ying

质粒模板要酶切线性化之后用蛋白酶K消化，酚抽，乙醇沉淀。转录时一定要加RNAse抑制剂RNAsin。全程要无RNAse。
! {) i3 o5 v% G1 j% c我觉得你这是转录时有污染。是不是没有加RNAsin啊？一般不会是跑胶的时候坏的。8 _/ B+ V& E: t! `! L
我做的按你这一样的条件跑胶会是一条或两条带（两条带可能是非变性的情况下有二级结构），都是好的。) D5 V# K' |* `* s8 Y

dianying

回复 runsong 的帖子8 g% B8 t  M9 \
. _# d# o' i- o1 b3 H6 a
看起来像你的样品本身降解。