最近要开始去小鼠的骨髓细胞了，一些疑问还希望前辈们不吝赐教，谢谢哦！

pear7127

以前没做过这方面的实验，最近要开始去小鼠的骨髓细胞了，一些疑问还希望前辈们不吝赐教，谢谢哦！
, H( f& `+ o; z1 V, q( {* ]) ?查了好一些资料，有以下问题：
/ p0 O: J1 h+ f  e; A$ H1：取出小鼠骨的时候上面都附着不少的肌肉和结缔组织，剪的时候很费力，有没有什么技巧？或者是一个熟能生巧的问题？+ u9 k* h! D2 X4 ?
2：小鼠的股骨，胫骨其实都挺小的，要剪掉两端，这个尺度怎么控制？而且发现1ml的针头直接穿刺也不太容易。
. \- J( {2 ?2 K3：有不少帖子说1ml注射器对细胞损伤比较大，那么这个损伤是针头还是针管的容积带来的？因为有看到一些同学说把1ml的针头换在5ml的针管上就能得到很好的效果。! D4 z/ A! @7 C- S$ c, \5 N
4：看到泡酒精感觉长见识了，不过还是有个小小的疑问，前面有同学说，不能连带肌肉泡，那么既然肌肉都已经剔除干净了，还需要泡酒精吗？不如直接开始冲细胞了？
# q7 C" F9 U3 x' z7 \/ ]5：冲出来的细胞液是直接冲进离心管/培养皿中吗？不需要滤膜过滤一下？
6 D+ J5 U. T7 q& t$ W, X+ \; ^6：裂解红细胞的时候是在常温下吗？% ]0 D% O6 S2 Z- o/ D
7：有没有专门的资料介绍小鼠的骨髓细胞？取出骨髓细胞以后，怎么判断干细胞？贴壁的细胞就是吗？
3 w6 X: g0 p0 d# W9 E
. U. g4 Q( o5 i# X4 [* E4 J& d: A/ `暂时想到这些问题，目前实验室没有师兄师姐可以请教，很多细节都不懂，所以只能求助大家，万谢！

pear7127

PS：还有一个关于细胞吹打的问题，好多前辈都说细胞一定要吹打均匀，可是我不知道应该怎么判断才知道是吹打均匀了。
1 K: n8 K1 \" R5 K谢谢大家~~

quanri1126

回复 pear7127 的帖子
( I! [9 k, C; F* p" [/ ?4 `8 R: v; x( P2 z, {$ L* ~
我们是做取巨噬细胞，不知道一不一样啊
; G7 j/ J' a9 e/ E  ~1. 大概 剪下来后，骨头用卫生纸擦，很容易就可以把肌肉等擦掉0 x0 ]. m' g- {
2. 剪的尽量少最好，只要能让注射器插进去，另一头pbs能冲洗出来就行了: l$ y% u' [3 a' b6 l- P$ X
3. 我们用的5ml注射器，也很容易插进骨头内，一般是从骨头大的那头插- D7 ]/ n: P' O! |" i8 k5 Z! n1 Z# J
4. 酒精用75%普通消毒的就行了，而且也不麻烦
5 E4 h4 J) N+ _: g' S% v. T5. 没过滤过，直接冲离心管里头# S% T7 _( t' }( i( i
6. 我们用冷的TDW裂解细胞，在常温下就行了- z4 F/ y# s+ G: B) t

lovesxj941

1.可以用咬骨钳夹住以后用刀片刮  注意无菌哦  或者直接放到PBS的皿里  夹起来肉 剪掉    一般认为中间留点肉没关系
. w. G( ?/ d; U$ N- X' c2.只要剪开口就好   因为干细胞大多集中于关节的位置  剪多了反而浪费。3.可以换个大点的针头  这样会硬一些  我一般用5ml的注射器。
5 C+ P7 a9 a7 B7 r7 i6 a) a4.我建议你不要泡酒精  直接全程尽量无菌操作。5.一般是200目或400目滤网过滤。6.看说明书。7. 一般会在48小时贴壁。

lovesxj941

1.可以用咬骨钳夹住以后用刀片刮  注意无菌哦  或者直接放到PBS的皿里  夹起来肉 剪掉    一般认为中间留点肉没关系
: A: J' T) O! h' v' y: z2.只要剪开口就好   因为干细胞大多集中于关节的位置  剪多了反而浪费。3.可以换个大点的针头  这样会硬一些  我一般用5ml的注射器。
: e6 @' ~9 B) d3 \  l4.我建议你不要泡酒精  直接全程尽量无菌操作。5.一般是200目或400目滤网过滤。6.看说明书。7. 一般会在48小时贴壁。

pear7127

回复 quanri1126 的帖子5 y( b1 p9 N( m( T( c+ A
' _0 |6 c* h+ X
非常感谢！

pear7127

回复 lovesxj941 的帖子1 \. E; `" D& H" a, A4 Y( A5 r
$ D( e$ D! K8 a! i2 d
非常感谢！

pear7127

没想到竟然被版主细心地发帖，还得到了前辈认真的回复，太感谢了！会加油的！

星火燎原

1、熟能生巧，两个人配合着
8 @! `) \+ Z8 _- y2、尺度尽量小，但也别太小心了4 H2 q1 u& G; C( @
3、我用2ml注射器，冲的过程中先用针头来回穿梭几次，要不压力太大( n/ [# v$ Y$ ]* J' C- T+ \
4、剔除的过程中注意无菌，之后用生理盐水冲洗一下，不需要用酒精泡，直接冲就行
1 ], y8 ^, U- ~( Y  S, ]5、我是在培养 皿中冲洗，冲的时候注意力度，冲到骨髓腔发白为止（用止血钳掰断），之后再转移到离心管，不需要滤膜过滤，沉淀pbs悬浮，ficoll分离
) o$ z/ S$ f2 K9 h$ n- r* b4 p6、洗涤2次之后用培养液悬浮细胞，48h后半换或全换（看情况），换液迟了会有很多杂细胞贴壁，影响干细胞生长，4~5天出现集落, L! \, }+ S& j7 v; I
7、吹打均匀情况可在吹打之后显微镜下观察成团细胞多不多，别吹得太猛
' Z5 e/ P) t( S. G" E+ }  I! a8、冲细胞用培养基（加血清更好）更好

nicholas_cyy

回复 星火燎原 的帖子8 S: F- n* b( o" G& s

6、洗涤2次之后用培养液悬浮细胞，48h后半换或全换（看情况），换液迟了会有很多杂细胞贴壁，影响干细胞生长，4~5天出现集落) a" |& s* |- _/ N$ D9 p
+ L! W( _8 W; z4 k* D

3 g% X$ Y+ l# J" }7 ^2 r
太早会不会影响贴壁啊