最近要开始去小鼠的骨髓细胞了，一些疑问还希望前辈们不吝赐教，谢谢哦！

pear7127

以前没做过这方面的实验，最近要开始去小鼠的骨髓细胞了，一些疑问还希望前辈们不吝赐教，谢谢哦！
# z! q( [7 X+ C# U, h4 t查了好一些资料，有以下问题：' q( v+ A8 ^1 [4 q# I: @
1：取出小鼠骨的时候上面都附着不少的肌肉和结缔组织，剪的时候很费力，有没有什么技巧？或者是一个熟能生巧的问题？4 v# P6 I0 i7 l
2：小鼠的股骨，胫骨其实都挺小的，要剪掉两端，这个尺度怎么控制？而且发现1ml的针头直接穿刺也不太容易。
* X+ _* t6 e; y! Y8 u3：有不少帖子说1ml注射器对细胞损伤比较大，那么这个损伤是针头还是针管的容积带来的？因为有看到一些同学说把1ml的针头换在5ml的针管上就能得到很好的效果。
7 w# ?3 f% L) {4 ^4：看到泡酒精感觉长见识了，不过还是有个小小的疑问，前面有同学说，不能连带肌肉泡，那么既然肌肉都已经剔除干净了，还需要泡酒精吗？不如直接开始冲细胞了？
8 c3 H; \; U( @5：冲出来的细胞液是直接冲进离心管/培养皿中吗？不需要滤膜过滤一下？
& {2 r* o2 L8 q+ x' k9 B( c6：裂解红细胞的时候是在常温下吗？
8 D- Z0 _1 G, P% E# |& z. J7：有没有专门的资料介绍小鼠的骨髓细胞？取出骨髓细胞以后，怎么判断干细胞？贴壁的细胞就是吗？1 k) }1 r/ \5 z- X& F9 O5 @

. k  Q" A* m: k: \暂时想到这些问题，目前实验室没有师兄师姐可以请教，很多细节都不懂，所以只能求助大家，万谢！

pear7127

PS：还有一个关于细胞吹打的问题，好多前辈都说细胞一定要吹打均匀，可是我不知道应该怎么判断才知道是吹打均匀了。6 W& C0 G1 D/ X. a& C
谢谢大家~~

quanri1126

回复 pear7127 的帖子
! A, E/ E+ A, w; W0 e: G# G
, z5 u- z/ \0 y' L5 r+ I6 |& K我们是做取巨噬细胞，不知道一不一样啊   o; s9 ]7 ?  f8 p; D
1. 大概 剪下来后，骨头用卫生纸擦，很容易就可以把肌肉等擦掉/ D+ i7 X1 R3 V7 C2 u
2. 剪的尽量少最好，只要能让注射器插进去，另一头pbs能冲洗出来就行了3 n3 M. A6 T5 @& r+ }  d. L
3. 我们用的5ml注射器，也很容易插进骨头内，一般是从骨头大的那头插
; m* z. s7 x8 Q7 z! t4. 酒精用75%普通消毒的就行了，而且也不麻烦; F( [! @" h+ u  D6 T
5. 没过滤过，直接冲离心管里头+ n/ S$ L4 C: F% G. u2 c3 L
6. 我们用冷的TDW裂解细胞，在常温下就行了
# [, b- a3 X- V' `7 K$ @& x

lovesxj941

1.可以用咬骨钳夹住以后用刀片刮  注意无菌哦  或者直接放到PBS的皿里  夹起来肉 剪掉    一般认为中间留点肉没关系
/ M- L( B6 D7 S' C! I2.只要剪开口就好   因为干细胞大多集中于关节的位置  剪多了反而浪费。3.可以换个大点的针头  这样会硬一些  我一般用5ml的注射器。
) o) \5 c+ h, }) u4.我建议你不要泡酒精  直接全程尽量无菌操作。5.一般是200目或400目滤网过滤。6.看说明书。7. 一般会在48小时贴壁。

lovesxj941

1.可以用咬骨钳夹住以后用刀片刮  注意无菌哦  或者直接放到PBS的皿里  夹起来肉 剪掉    一般认为中间留点肉没关系3 {" r6 M7 `( l! ?5 v* n. D; H) x
2.只要剪开口就好   因为干细胞大多集中于关节的位置  剪多了反而浪费。3.可以换个大点的针头  这样会硬一些  我一般用5ml的注射器。& o% [; U/ T" u- n& d2 V* a' A) f! H+ t
4.我建议你不要泡酒精  直接全程尽量无菌操作。5.一般是200目或400目滤网过滤。6.看说明书。7. 一般会在48小时贴壁。

pear7127

回复 quanri1126 的帖子
& K% P( l4 C2 m
8 p4 [: I- V; D8 U* W. Z$ \" n非常感谢！

pear7127

回复 lovesxj941 的帖子# M; H* G( a4 _/ r% f$ O) o

" T: n& W! n- ]7 L8 W4 S  E) P6 p, O非常感谢！

pear7127

没想到竟然被版主细心地发帖，还得到了前辈认真的回复，太感谢了！会加油的！

星火燎原

1、熟能生巧，两个人配合着
  r" F& Z( i- B3 }9 K2 B2、尺度尽量小，但也别太小心了) k6 |1 z2 m8 u6 v, p, x9 J
3、我用2ml注射器，冲的过程中先用针头来回穿梭几次，要不压力太大
8 r) \4 M7 }! @+ `5 M- i6 \4、剔除的过程中注意无菌，之后用生理盐水冲洗一下，不需要用酒精泡，直接冲就行( e0 T8 E$ {: n& \3 H
5、我是在培养 皿中冲洗，冲的时候注意力度，冲到骨髓腔发白为止（用止血钳掰断），之后再转移到离心管，不需要滤膜过滤，沉淀pbs悬浮，ficoll分离
2 }) ?$ F6 u  X% [6、洗涤2次之后用培养液悬浮细胞，48h后半换或全换（看情况），换液迟了会有很多杂细胞贴壁，影响干细胞生长，4~5天出现集落6 \: ?% x0 v0 q7 \+ r6 k1 K
7、吹打均匀情况可在吹打之后显微镜下观察成团细胞多不多，别吹得太猛
  I0 r* r: y6 s5 Q8、冲细胞用培养基（加血清更好）更好

nicholas_cyy

回复 星火燎原 的帖子
- {6 }1 `' w' ]$ H6 M( D! }3 U. ~2 S

6、洗涤2次之后用培养液悬浮细胞，48h后半换或全换（看情况），换液迟了会有很多杂细胞贴壁，影响干细胞生长，4~5天出现集落
: S& U* f4 q! H+ L! W( _8 W; z4 k* D

3 Q0 d, r% ?. V- w2 N) l& R太早会不会影响贴壁啊