最近要开始去小鼠的骨髓细胞了，一些疑问还希望前辈们不吝赐教，谢谢哦！

pear7127

以前没做过这方面的实验，最近要开始去小鼠的骨髓细胞了，一些疑问还希望前辈们不吝赐教，谢谢哦！4 }! c7 V* ]7 f( p1 ]0 L, T# Z
查了好一些资料，有以下问题：
7 V; y$ n0 w8 U0 o$ E) N, k1：取出小鼠骨的时候上面都附着不少的肌肉和结缔组织，剪的时候很费力，有没有什么技巧？或者是一个熟能生巧的问题？
8 W6 k) Q- x1 f7 O! f6 W2：小鼠的股骨，胫骨其实都挺小的，要剪掉两端，这个尺度怎么控制？而且发现1ml的针头直接穿刺也不太容易。
. N, U* W- L. \9 T3 m2 R' Q# q3：有不少帖子说1ml注射器对细胞损伤比较大，那么这个损伤是针头还是针管的容积带来的？因为有看到一些同学说把1ml的针头换在5ml的针管上就能得到很好的效果。
, t; x& _+ E/ ^: v/ D4：看到泡酒精感觉长见识了，不过还是有个小小的疑问，前面有同学说，不能连带肌肉泡，那么既然肌肉都已经剔除干净了，还需要泡酒精吗？不如直接开始冲细胞了？2 D+ g( ?6 N' m( ?
5：冲出来的细胞液是直接冲进离心管/培养皿中吗？不需要滤膜过滤一下？
7 a1 K/ R4 D6 f3 {# A) D6：裂解红细胞的时候是在常温下吗？
  }5 B2 X" t% d- f2 b7：有没有专门的资料介绍小鼠的骨髓细胞？取出骨髓细胞以后，怎么判断干细胞？贴壁的细胞就是吗？
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6 w( u% _/ x. `暂时想到这些问题，目前实验室没有师兄师姐可以请教，很多细节都不懂，所以只能求助大家，万谢！

pear7127

PS：还有一个关于细胞吹打的问题，好多前辈都说细胞一定要吹打均匀，可是我不知道应该怎么判断才知道是吹打均匀了。* E$ l7 S, M! W$ E3 m: [
谢谢大家~~

quanri1126

回复 pear7127 的帖子. L* O& S- |; X, x& \/ x

; k" F# ^- Z9 w, n/ S我们是做取巨噬细胞，不知道一不一样啊 & d* b! h0 L+ D4 N8 a
1. 大概 剪下来后，骨头用卫生纸擦，很容易就可以把肌肉等擦掉
! W. X. [' I, C' Z4 X: N2. 剪的尽量少最好，只要能让注射器插进去，另一头pbs能冲洗出来就行了9 F8 E% A& z/ p) k0 o; r! l
3. 我们用的5ml注射器，也很容易插进骨头内，一般是从骨头大的那头插" Z' W. d$ J/ T- n9 T
4. 酒精用75%普通消毒的就行了，而且也不麻烦- W; E7 q0 d! j# A
5. 没过滤过，直接冲离心管里头
1 N2 A# c, ^! I6. 我们用冷的TDW裂解细胞，在常温下就行了
+ M" ^0 ]$ V+ X- f! W/ c; z* P3 y

lovesxj941

1.可以用咬骨钳夹住以后用刀片刮  注意无菌哦  或者直接放到PBS的皿里  夹起来肉 剪掉    一般认为中间留点肉没关系) l: L" [3 @! l9 F/ D) `+ _6 l
2.只要剪开口就好   因为干细胞大多集中于关节的位置  剪多了反而浪费。3.可以换个大点的针头  这样会硬一些  我一般用5ml的注射器。' J+ H* q0 x7 P9 M; ]+ P
4.我建议你不要泡酒精  直接全程尽量无菌操作。5.一般是200目或400目滤网过滤。6.看说明书。7. 一般会在48小时贴壁。

lovesxj941

1.可以用咬骨钳夹住以后用刀片刮  注意无菌哦  或者直接放到PBS的皿里  夹起来肉 剪掉    一般认为中间留点肉没关系) C  Z( Y( v# g( O4 b
2.只要剪开口就好   因为干细胞大多集中于关节的位置  剪多了反而浪费。3.可以换个大点的针头  这样会硬一些  我一般用5ml的注射器。
8 \8 l" ?1 s% l1 ~. e4.我建议你不要泡酒精  直接全程尽量无菌操作。5.一般是200目或400目滤网过滤。6.看说明书。7. 一般会在48小时贴壁。

pear7127

回复 quanri1126 的帖子& z% u* Q, H* I2 K" I0 s

+ f9 ~0 \9 S, }: j非常感谢！

pear7127

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6 `8 T& W/ }9 f( [
8 P2 F( _$ E+ i" |& W1 x非常感谢！

pear7127

没想到竟然被版主细心地发帖，还得到了前辈认真的回复，太感谢了！会加油的！

星火燎原

1、熟能生巧，两个人配合着" Q) _5 s8 q( P# m( k+ ]
2、尺度尽量小，但也别太小心了
- P+ q5 a1 j" a# N% c* C$ t3、我用2ml注射器，冲的过程中先用针头来回穿梭几次，要不压力太大
. k% m& ^: G2 a" b' L2 g. u4、剔除的过程中注意无菌，之后用生理盐水冲洗一下，不需要用酒精泡，直接冲就行
+ d+ v  z. d  Q! N5、我是在培养 皿中冲洗，冲的时候注意力度，冲到骨髓腔发白为止（用止血钳掰断），之后再转移到离心管，不需要滤膜过滤，沉淀pbs悬浮，ficoll分离
% K! m. M) A  ^, X: p6、洗涤2次之后用培养液悬浮细胞，48h后半换或全换（看情况），换液迟了会有很多杂细胞贴壁，影响干细胞生长，4~5天出现集落5 V" J! S- N/ x: ^1 l5 o9 K
7、吹打均匀情况可在吹打之后显微镜下观察成团细胞多不多，别吹得太猛
2 r9 Z7 w1 x* \( v& N2 O8、冲细胞用培养基（加血清更好）更好

nicholas_cyy

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6、洗涤2次之后用培养液悬浮细胞，48h后半换或全换（看情况），换液迟了会有很多杂细胞贴壁，影响干细胞生长，4~5天出现集落
) s" L: f1 n0 L+ N; l+ L! W( _8 W; z4 k* D

7 r# e3 c( f' R: z$ v# n太早会不会影响贴壁啊