DC细胞的培养方案和流式检测？

hwlightning

1、准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC）。5 [1 D- z0 t# }* D
2、将外周血单个核细胞在铺在培养瓶中，用加入25 mL免疫细胞无血清培养基
$ [  B7 f: l% \. _3、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中孵育2〜3小时$ Y$ J; f" y- g( j& D
4、弃掉含非贴壁细胞的培养基  R- c( n% u: F5 A0 y. X
5、添加50 ng / mL的重组人IL-4和100 ng / mL的重组人GM-CSF
& r" j; {; G2 g" c" b) q6、两天后半量换液，同时添加IL-4和GM-CSF. C$ m) `/ F5 s' J5 E& S. K3 E
7、5天后添加TNF-α进行诱导50ng/ml，诱导1~2天
; J& v! R) v5 Q1 N; j7 L不知道这个方案会不会存在一些问题，因子的浓度合适吗？) c- a3 |9 k5 e
诱导后的DC不增值，一般100ml外周血能诱导出DC细胞的量是多少？. R" p: k$ W( V: ]8 P
流式检测CD80, CD86,CD83、CD11c、HLA-DR，做完表型分析，基本上就没有多少细胞了，或者根本就不够用来做表型分析.. V, {- e  u, A$ C
请问下做DC-CIK细胞回输人体，要不要做流式分析？

yubin083

就我的经验，DC一般不会是梭形很长的那种细胞，如果你想证实，可以做FACS检测其phenotype

星火燎原

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" y7 f2 x# n, U3 m+ R5 b) D不用就在原瓶就成，加tnf之前不用吹

hwlightning

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1 P/ W- z! D0 T9 @3 k( [. W: }( f5 n9 t" l2 X
最后加TNF诱导成熟的时候，要不要把细胞吹起来加入另一个培养瓶再进行诱导？？？3 J. u" x9 D4 q' Y0 k* m

星火燎原

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9 l; Z/ A, `- b
有的，诱导也不会是同步的，出细胞的时候吹打一下

hwlightning

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  k3 J/ J- f( n+ |
我觉得贴壁的细胞有可能也有DC细胞吧？？？？

星火燎原

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7 [7 u4 B* _  |+ s3 @8 P: Z
8 i6 h/ i: C# b  \0 n5 A我觉得尽量别去动它，成熟过程中

hwlightning

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: N. C: b, T" _8 E, h4 a5 m. Z) C! Z1 N, z1 u
我看贴壁的细胞是那种很细长的那种，比直的梭型，两端很细长。( L9 Y9 p5 ?. J
细长端有的又有很多分枝。
) I5 ?7 D- B( g' Q' B4 G再请问下加TNF-a刺激成熟时要不要把贴壁的细胞吹打起来
% A4 k4 a% Y- r$ ]- p0 x就是最后一次加因子要不要吹打细胞？

hwlightning

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# i3 M7 a' U# L7 ]3 O
那不是对因子的需求量很大，可不可以先把细胞吹打下来离心后加完全培养基重悬刺激成熟？

星火燎原

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! P# P! ]) L* g5 z* M3 y2 {) o$ f" h$ d4 Y. Y" \
换液肯定损失细胞，可以不用换液，补培养基同时补加因子