DC细胞的培养方案和流式检测？

hwlightning

1、准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC）。. ]3 }& R2 H7 S3 N
2、将外周血单个核细胞在铺在培养瓶中，用加入25 mL免疫细胞无血清培养基3 N, h) m0 Z, D% ?3 y0 \
3、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中孵育2〜3小时
; _- O' `' y' P# m% l3 V0 a4、弃掉含非贴壁细胞的培养基
" _' h* c( V* {% Y% z% C5、添加50 ng / mL的重组人IL-4和100 ng / mL的重组人GM-CSF6 Y; t# U3 S2 B- r  c) }
6、两天后半量换液，同时添加IL-4和GM-CSF' V8 S; E" I9 u# V8 @+ s
7、5天后添加TNF-α进行诱导50ng/ml，诱导1~2天
' y2 \3 G" R/ R- X9 p4 r不知道这个方案会不会存在一些问题，因子的浓度合适吗？
' b. h0 }2 f- Q. G. J/ W9 \6 s诱导后的DC不增值，一般100ml外周血能诱导出DC细胞的量是多少？' H) y1 E4 F$ y) A$ p6 a
流式检测CD80, CD86,CD83、CD11c、HLA-DR，做完表型分析，基本上就没有多少细胞了，或者根本就不够用来做表型分析.
( t- n/ C! [& x! z- U/ y+ g9 o; l请问下做DC-CIK细胞回输人体，要不要做流式分析？

flowguo

        以前养过，看步骤应该差不多，细胞因子浓度具体记不清了，不过很多文献上都有诱导方案，一般没有什么问题。我觉得单核诱导DC经常会混有很多淋巴细胞，贴壁后最好洗干净一点。
# m; x- S% ~! E; \0 ^1 e     以前都是200ml的血，诱导一个星期不出问题的话1X10^7没问题，纯度能有80-90%，多多少少还是会有淋巴细胞。不过时好时坏，有时候也很差，都不知道什么原因。
& F5 @7 E# z8 K& e$ S     表型鉴定我觉得你不一定每次都做吧，养多了有感觉的，树突的形态很典型，真要要求高的可以挑选着做，流式多标的话也要不了多少细胞。
- d/ k" Q$ e4 o      临床试验不是很了解，同问。

flowguo

        以前养过，看步骤应该差不多，细胞因子浓度具体记不清了，不过很多文献上都有诱导方案，一般没有什么问题。我觉得单核诱导DC经常会混有很多淋巴细胞，贴壁后最好洗干净一点。
1 t' P* {2 b% S" p; }; e     以前都是200ml的血，诱导一个星期不出问题的话1X10^7没问题，纯度能有80-90%，多多少少还是会有淋巴细胞。不过时好时坏，有时候也很差，都不知道什么原因。
6 o; R1 N; T: F, c* k3 R     表型鉴定我觉得你不一定每次都做吧，养多了有感觉的，树突的形态很典型，真要要求高的可以挑选着做，流式多标的话也要不了多少细胞。
5 c, g& @) @' z& }8 |; t      临床试验不是很了解，同问。

yubin083

想问下这样培养出来的细胞中有macrophage吗？如果有，大概有多少比例？

hwlightning

回复 yubin083 的帖子8 x1 v$ s6 L- `) E: u- h# {

6 K* ?6 {% u1 ~我今天看细胞的时候发现有很多贴壁的细胞，但是贴壁的细胞也有很多树突状。

透明之蓝

3、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中孵育2〜3小时9 g% U8 H/ x# ]& F
4、弃掉含非贴壁细胞的培养基
$ Y0 I8 l0 t+ t
# T5 t; W2 y$ K/ d- b7 ~) n1 E! d7 ^弃掉培养基要注意，格外小心，轻轻操作！！要不细胞会损失很多！！
. z/ [, z+ {7 j0 q* A关于其它问题，同问！！

yubin083

回复 hwlightning 的帖子
$ `" r' V$ x7 x, J7 v2 C8 ^
) F4 F- R5 }: b9 H1 m" W样子有树突，不一定是DC，有一部分可能是巨噬细胞，这种细胞有小突起，而且贴壁，比DC还牢靠

yubin083

关于血液中单核细胞的分化为Mφ和DC, K) J1 h9 Y4 w* h  G: w
这种关于这种DC（表面CD1+，CD11b+，CD14+/-）国际上是有争议的，至少已故ralph steinman教授就不认可

yubin083

诚然，从人体血液中培养获取获取DC亦然成为不少researcher的研究方法，我仅仅想了解依靠这种方法获得的DC的纯度到底有多少（排除淋巴细胞后），其表面CD表达的情况？

hwlightning

回复 yubin083 的帖子
- p2 i4 t- c8 ?' l, I
1 a- m/ ~; d+ g是不是成熟的DC细胞是悬浮的细胞，0 g* k, P: J1 Q# o# L- B
我最近看我养的DC有很多悬浮的，和贴壁的，如果我半量换液的话会不会损失掉很多细胞？3 d: [: w  Q0 Z1 B( m6 [