质粒酶切检测如何选择酶切位点？

kephort

现在在提取的有4种质粒，每种都挑了2-3个克隆，请问怎么进行酶切鉴定啊？% p. [: W& k" P( g  y8 q
选择单酶切和双酶切要注意什么？如果做PCR检测，引物是选哪个区段呢？什么情形下要做测序？

86964109

回复 mzaq2006 的帖子+ b$ @7 `1 K% B7 I: W8 A9 s" k' p0 O
" [9 P6 M' C$ `' s* f5 c2 a% L
应该一般是不用的，因为反向引物对应的是RT引物上通用的序列部分，退火条件如果和正向引物能匹配，基本上是不用换的，不过如果说和正向引物错配实在太多的话，可能需要考虑一下

mzaq2006

回复 86964109 的帖子: G/ |( y* J" G# X
0 A8 ^+ H- [; o- A% Z
非常感谢您的回复。我自己也了解到，茎环法涉及3条引物，一条是RT引物，一条是正向引物，一条是反向引物，一般都用的是通用引物，我有个问题是，反向引物是否可以针对不同的miRNA而设计特异的引物呢？什么情况下需要这样做呢？就是说，你必须要设计特异的反向引物。希望能得到解答，谢谢。

goast8

一般情况下，怎么插入怎么酶切鉴定就可以了。1 q- O3 S5 z% h# t, N8 M& C, H) O5 T
如果是特殊方法插入，无法用插入的双酶切鉴定，可以用插入片段外部的酶进行酶切，这时可能需要你对载体及你的插入序列有完整的信息。2 M* c% K4 w% M
现在分子克隆的常用酶，基本双酶切组合都没问题。也可以考虑快切酶鉴定，10多分钟就可以。
" V6 E% {  ]$ v% Z7 X2 Ypcr检测一般也用你之前克隆时设计的引物进行就可以了。一般情况下都是要测序确认的。

86964109

0 w) }+ k4 w1 B* ]* E( r4 n. T2 ]3 t4 |0 m/ }# O6 |' _
回复 mzaq2006 的帖子/ Z) o/ J5 |) z& K( U9 K
+ n8 ~% C5 N; m( |2 s5 d2 Z8 R$ L
有茎环法和加A法，一般用茎环法比较多可以参考以下文献 Real-Time PCR Quantification of Plant miRNAs Using Universal ProbeLibrary Technology.pdf (219.14 KB)

2013-1-14 08:08 上传

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mzaq2006

回复 军医 的帖子7 L4 a; h. e. ~' a( D4 j* {4 d
3 {( V- P! m8 h/ K! u5 n
那请问你知道miRNA的引物怎么设计的吗

军医

双酶切注意：1.两个酶的反应温度是否相同，不同的活就要分两次酶切
% G* o2 F& [; z1 x, {0 `% Y7 N- }                     2.注意内切酶是否是对甲基化敏感，有的酶需要用GM110这样的菌株转化，得到的质粒才能被切开。
3 Z. ^. T) z. X3 a' O& P                     3.两种酶是否有公用的buffer，无公用的buffer的话就要分两次切了。
: ?' @$ z1 K" e( y* U4 Y1 {9 ]                     4.不要把目的片段切开，无论是双酶切还是单酶切都要选在质粒上有单个酶切位点的内切酶。: P  g9 T% N7 h2 a9 N# x' T; L
                      5.单酶切和双酶切最好都做，保险。
8 c& H2 B- a, T! X# jPCR检测：    1.引物一般设计在插入片段两侧，如果是别人给的商业化质粒，最好在用测序引物测下多克隆位点，防止多克隆位点有突变。8 q' i8 c  t+ Q" U1 V
                     2.如果是插入片段的话，最好测序鉴定一下。PCR产物只看大小就能确定了。$ b4 s+ U0 v/ B5 i+ B1 ]. S