质粒酶切检测如何选择酶切位点？

kephort

现在在提取的有4种质粒，每种都挑了2-3个克隆，请问怎么进行酶切鉴定啊？
# a, H1 s  L/ M# _& P选择单酶切和双酶切要注意什么？如果做PCR检测，引物是选哪个区段呢？什么情形下要做测序？

军医

双酶切注意：1.两个酶的反应温度是否相同，不同的活就要分两次酶切
  y7 r+ F. f; Z                     2.注意内切酶是否是对甲基化敏感，有的酶需要用GM110这样的菌株转化，得到的质粒才能被切开。
! g5 t6 r5 `) `2 ~) Q+ i                     3.两种酶是否有公用的buffer，无公用的buffer的话就要分两次切了。; M# M+ a- M, a2 h( U3 T
                     4.不要把目的片段切开，无论是双酶切还是单酶切都要选在质粒上有单个酶切位点的内切酶。! a  N* L/ m7 H" g5 K- w
                      5.单酶切和双酶切最好都做，保险。4 {) _* ]3 I' }1 i
PCR检测：    1.引物一般设计在插入片段两侧，如果是别人给的商业化质粒，最好在用测序引物测下多克隆位点，防止多克隆位点有突变。
* Z  f9 O8 G& B" f0 T% X- B                     2.如果是插入片段的话，最好测序鉴定一下。PCR产物只看大小就能确定了。
5 b" j* o) X3 F( z, g                     

mzaq2006

回复 军医 的帖子% H! X/ j7 F/ p
8 }1 R. s5 {9 w/ p
那请问你知道miRNA的引物怎么设计的吗

86964109

) ?0 I- E# a# E+ ?) F
* D! g) B* _0 w- c回复 mzaq2006 的帖子1 n* x/ l! B% C; C8 O. N& `

! ^! S3 `. P% p. p有茎环法和加A法，一般用茎环法比较多可以参考以下文献 Real-Time PCR Quantification of Plant miRNAs Using Universal ProbeLibrary Technology.pdf (219.14 KB)

2013-1-14 08:08 上传

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goast8

一般情况下，怎么插入怎么酶切鉴定就可以了。" [/ b6 j; S9 g! l8 \9 i
如果是特殊方法插入，无法用插入的双酶切鉴定，可以用插入片段外部的酶进行酶切，这时可能需要你对载体及你的插入序列有完整的信息。. N  f+ w& e# _
现在分子克隆的常用酶，基本双酶切组合都没问题。也可以考虑快切酶鉴定，10多分钟就可以。
1 w& L! m2 \0 x8 G8 qpcr检测一般也用你之前克隆时设计的引物进行就可以了。一般情况下都是要测序确认的。

mzaq2006

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4 J: u" d# D- _
/ i  \) \. w/ t  x& q9 E非常感谢您的回复。我自己也了解到，茎环法涉及3条引物，一条是RT引物，一条是正向引物，一条是反向引物，一般都用的是通用引物，我有个问题是，反向引物是否可以针对不同的miRNA而设计特异的引物呢？什么情况下需要这样做呢？就是说，你必须要设计特异的反向引物。希望能得到解答，谢谢。

86964109

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* I8 j/ n; p' R% ^# r! k& _
7 V7 h4 l- K2 E1 e1 a应该一般是不用的，因为反向引物对应的是RT引物上通用的序列部分，退火条件如果和正向引物能匹配，基本上是不用换的，不过如果说和正向引物错配实在太多的话，可能需要考虑一下