质粒酶切检测如何选择酶切位点？

kephort

现在在提取的有4种质粒，每种都挑了2-3个克隆，请问怎么进行酶切鉴定啊？! @7 `: x5 |, V1 I8 G8 n- o. d% r
选择单酶切和双酶切要注意什么？如果做PCR检测，引物是选哪个区段呢？什么情形下要做测序？

86964109

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$ G0 i3 z1 s& x( x9 Q$ T+ R, d; a0 f- }
应该一般是不用的，因为反向引物对应的是RT引物上通用的序列部分，退火条件如果和正向引物能匹配，基本上是不用换的，不过如果说和正向引物错配实在太多的话，可能需要考虑一下

mzaq2006

回复 86964109 的帖子0 r7 e! k- k) y- M( n* F' _
- ?9 x+ C' ]/ d9 W9 c$ G
非常感谢您的回复。我自己也了解到，茎环法涉及3条引物，一条是RT引物，一条是正向引物，一条是反向引物，一般都用的是通用引物，我有个问题是，反向引物是否可以针对不同的miRNA而设计特异的引物呢？什么情况下需要这样做呢？就是说，你必须要设计特异的反向引物。希望能得到解答，谢谢。

goast8

一般情况下，怎么插入怎么酶切鉴定就可以了。
) c4 h6 l# X) ]2 g3 l如果是特殊方法插入，无法用插入的双酶切鉴定，可以用插入片段外部的酶进行酶切，这时可能需要你对载体及你的插入序列有完整的信息。
1 n6 P5 F, u# F0 I$ q现在分子克隆的常用酶，基本双酶切组合都没问题。也可以考虑快切酶鉴定，10多分钟就可以。0 R+ p+ ], Q5 h# h: P. _
pcr检测一般也用你之前克隆时设计的引物进行就可以了。一般情况下都是要测序确认的。

86964109

1 E+ V6 N1 G  b% A
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回复 mzaq2006 的帖子3 T- N2 o, |& y- y7 P

5 K2 c" A- L! ]" |有茎环法和加A法，一般用茎环法比较多可以参考以下文献 Real-Time PCR Quantification of Plant miRNAs Using Universal ProbeLibrary Technology.pdf (219.14 KB)

2013-1-14 08:08 上传

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mzaq2006

回复 军医 的帖子7 B4 ?& e* S! `+ q6 l
7 ~9 Y: M. g" u( B* N7 C4 C
那请问你知道miRNA的引物怎么设计的吗

军医

双酶切注意：1.两个酶的反应温度是否相同，不同的活就要分两次酶切. G2 l) q- ], v6 I$ B
                     2.注意内切酶是否是对甲基化敏感，有的酶需要用GM110这样的菌株转化，得到的质粒才能被切开。
' G2 ~- f' U( j                     3.两种酶是否有公用的buffer，无公用的buffer的话就要分两次切了。  ^& J: u; i, {3 j
                     4.不要把目的片段切开，无论是双酶切还是单酶切都要选在质粒上有单个酶切位点的内切酶。
9 |4 R* b, i2 h1 ]                      5.单酶切和双酶切最好都做，保险。0 j9 n% A2 u  D9 |
PCR检测：    1.引物一般设计在插入片段两侧，如果是别人给的商业化质粒，最好在用测序引物测下多克隆位点，防止多克隆位点有突变。
- F$ o, e& ?; }1 Y8 w. M" @                     2.如果是插入片段的话，最好测序鉴定一下。PCR产物只看大小就能确定了。
4 a: @( p  P- y0 g  J