质粒酶切检测如何选择酶切位点？

kephort

现在在提取的有4种质粒，每种都挑了2-3个克隆，请问怎么进行酶切鉴定啊？
( e5 j7 T. [; o8 J0 F. z选择单酶切和双酶切要注意什么？如果做PCR检测，引物是选哪个区段呢？什么情形下要做测序？

军医

双酶切注意：1.两个酶的反应温度是否相同，不同的活就要分两次酶切
2 H% x, h/ e# u5 H$ Y. [                     2.注意内切酶是否是对甲基化敏感，有的酶需要用GM110这样的菌株转化，得到的质粒才能被切开。( {7 Z; E* c; R( F% n
                     3.两种酶是否有公用的buffer，无公用的buffer的话就要分两次切了。
2 L! Q- ]! D- |: _7 k/ N                     4.不要把目的片段切开，无论是双酶切还是单酶切都要选在质粒上有单个酶切位点的内切酶。. H, G& q" H* J2 v+ e9 L
                      5.单酶切和双酶切最好都做，保险。) B  y; `. E. l: O# j
PCR检测：    1.引物一般设计在插入片段两侧，如果是别人给的商业化质粒，最好在用测序引物测下多克隆位点，防止多克隆位点有突变。
" n8 w8 `; C5 c. G: L! t                     2.如果是插入片段的话，最好测序鉴定一下。PCR产物只看大小就能确定了。
6 Y8 c0 g3 H4 [; W  _1 H6 a) q                     

mzaq2006

回复 军医 的帖子. E( |  c! [2 I' U  y6 J

( k4 _$ z; ^* |- M& v那请问你知道miRNA的引物怎么设计的吗

86964109

3 J3 f8 ?# |) s  T, W; }
* p2 P* ^! Z3 Q& h1 M' D2 C
回复 mzaq2006 的帖子* P' U% U9 M9 e
; m  g. [* @% q0 I  p9 S) ?
有茎环法和加A法，一般用茎环法比较多可以参考以下文献 Real-Time PCR Quantification of Plant miRNAs Using Universal ProbeLibrary Technology.pdf (219.14 KB)

2013-1-14 08:08 上传

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goast8

一般情况下，怎么插入怎么酶切鉴定就可以了。
. n/ I8 P2 ~( O如果是特殊方法插入，无法用插入的双酶切鉴定，可以用插入片段外部的酶进行酶切，这时可能需要你对载体及你的插入序列有完整的信息。5 o% v- h7 p1 F# _7 |  |6 ?
现在分子克隆的常用酶，基本双酶切组合都没问题。也可以考虑快切酶鉴定，10多分钟就可以。
) z/ p+ m5 ~6 D. Y1 f* Hpcr检测一般也用你之前克隆时设计的引物进行就可以了。一般情况下都是要测序确认的。

mzaq2006

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) ~& v; Z% ~: i% |2 b
' C* ^8 ~& P* t2 Q) K. @' l4 j非常感谢您的回复。我自己也了解到，茎环法涉及3条引物，一条是RT引物，一条是正向引物，一条是反向引物，一般都用的是通用引物，我有个问题是，反向引物是否可以针对不同的miRNA而设计特异的引物呢？什么情况下需要这样做呢？就是说，你必须要设计特异的反向引物。希望能得到解答，谢谢。

86964109

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; r' w, F. N/ J0 ^1 ~7 C! V& O/ q6 _* b- S! h2 l( S& v
应该一般是不用的，因为反向引物对应的是RT引物上通用的序列部分，退火条件如果和正向引物能匹配，基本上是不用换的，不过如果说和正向引物错配实在太多的话，可能需要考虑一下