分离PBMC时的疑问？

gengtongyu521

分离PBMC时，有时会多吸取一些下方的分离液，以免细胞的浪费，这样，再离心时会不会不容易使单个核细胞离心下来，而悬浮在液体中呢？

Jonathan

不会。因为洗的时候用的是PBS，两个应该是可以互溶的。。9 q% z1 u3 S* R; J

HHvivian

如果有这种顾虑，PBS加多点。我也做过PBMC的分离，但未出现过单个核细胞离心不下来的情况。PBMC的分离还是比较容易的。

defu

操作基本过程如下：" Q* `: Z1 j6 z) Y( N. L
" M/ s: J# p9 \8 |+ M, m
1、抗凝血约8ml，2h内收集，混匀充分；
' X; e% [7 U& d% G% ^# \
- d- l% B  G( E! S2、复温淋巴细胞分离液及1640；（室温自然复温2h或水浴锅中1-5min）# w2 n, m6 x6 l! Y+ T

- E/ [7 c8 k) b  J5 F! D( X& Y3、2支15ml离心管中各加入4ml淋巴细胞分离液，离心2min离下管壁上液体；
5 \' p" r  A' w5 I4 j! x: S5 A' x$ w' I% c' t$ c% A2 c
4、将8ml血吸至50ml离心管中，加入约8ml1640，混匀；
( j' U( @) s% U) J3 y: w: Q% y" x: g# Q
5、使用BD产3ml一次性无菌塑料吸管，将混匀后的血慢慢加到淋巴细胞分离液上；. E2 u# g: O9 I- t, G2 A' b1 R1 W

7 `' ~% [: Z5 ]+ _3 s( c8 n' q9 Q! A6、1600rpm（440g/min），30min离心；
& O' l) f( q! c4 I3 e5 D; T0 k- U" o
7、吸取上层血浆，用玻璃吸管吸取PBMC层至一新15ml离心管，加入1640至14ml，混匀；& g/ y/ O& s9 F; Q

. c; k# i- E+ E4 F* _, S/ @* Z5 l8、1300rpm（290g/min），10min离心；8 ^2 q9 ?' X0 V$ I' a8 W
8 B- @) T) h1 V8 P; f% W9 Q
9、同样方法再次洗涤。
* c9 K, _7 z; z: K& p5 p% G# m% V# a% T8 l

pengxuleo

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! J" h* V7 ?: s7 x) e3 Q6 G, k1 |) C3 h# V
不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

pengxuleo

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不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

pengxuleo

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# n: J& |3 H, V- A  B1 R) o
. F; \3 p' n! H" ^- g5 V& q7 L8 S3 M* ^不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

easternliu

上面的人吹牛，我之前有遇到，细胞都跑到分离液当中了，所以吸了很多分离液，当时头脑发热没混匀，所以离心出现你说的现象，细胞没下来。所以吸了分离液一定要混匀，尽量不要吸太多分离液，如果没办法太多了，可以适当增加离心转速。关键是要混匀。。。

sunny.yc

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" {0 u2 ~0 t# Q. @5 J2 D多吸一些没关系，只要别吸太多淋巴细胞分离液当中的”杂质“和下面的其他细胞就行了，然后用DPBS或1640混匀一下细胞，完全没有问题，我一直都是这么做的

pengxuleo

回复 easternliu 的帖子2 C2 X4 \# {6 |8 y

) Y& c* z' d" L" d' `你说我吹牛也得好好看看内容啊，混不混匀是实验常识问题，没人会专门提出来