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标题:
分离PBMC时的疑问？
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作者:
gengtongyu521
时间:
2013-1-23 10:42
标题:
分离PBMC时的疑问？
分离PBMC时，有时会多吸取一些下方的分离液，以免细胞的浪费，这样，再离心时会不会不容易使单个核细胞离心下来，而悬浮在液体中呢？
作者:
Jonathan
时间:
2013-1-23 11:31
不会。因为洗的时候用的是PBS，两个应该是可以互溶的。。
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作者:
HHvivian
时间:
2013-1-23 11:43
如果有这种顾虑，PBS加多点。我也做过PBMC的分离，但未出现过单个核细胞离心不下来的情况。PBMC的分离还是比较容易的。
作者:
defu
时间:
2013-1-23 15:40
操作基本过程如下：
: r0 W; z# X. u" h. C- E: o
0 N8 ~1 ]: _/ Z/ ^6 N
1、抗凝血约8ml，2h内收集，混匀充分；
3 `0 i) I: }. [ Y0 O/ P7 b4 o6 K
/ G/ C% t& J6 a% a7 J
2、复温淋巴细胞分离液及1640；（室温自然复温2h或水浴锅中1-5min）
. V; V: U x6 `9 x3 q% X9 I! D/ ~
4 e' P1 Y( j6 r0 j! |6 l5 B* k
3、2支15ml离心管中各加入4ml淋巴细胞分离液，离心2min离下管壁上液体；
3 [6 G8 S9 ] y8 S" o6 }: ^& c% {! W
3 z+ V) T; P2 z( B) k; X4 |9 {5 T! p
4、将8ml血吸至50ml离心管中，加入约8ml1640，混匀；
6 S+ t5 K& h, q# [0 y! U3 [
0 e# a1 M* h9 ?1 O6 E! ]) d
5、使用BD产3ml一次性无菌塑料吸管，将混匀后的血慢慢加到淋巴细胞分离液上；
3 a2 n) H/ j# g7 s# m
5 e2 D' d0 @4 S2 K, v
6、1600rpm（440g/min），30min离心；
" h% ?& O+ F7 ? ~, ` w
' p1 N5 g. f- j( w0 s% M. m+ Q
7、吸取上层血浆，用玻璃吸管吸取PBMC层至一新15ml离心管，加入1640至14ml，混匀；
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8、1300rpm（290g/min），10min离心；
4 m2 ^. l3 M; J {1 H
0 e+ ^. ], I8 E6 q9 c- Z* L, [
9、同样方法再次洗涤。
3 f! F3 m& \# Z l% G' y
1 H5 ~) L$ l7 i
作者:
pengxuleo
时间:
2013-1-24 09:52
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gengtongyu521
的帖子
# o4 U$ G# ^. }3 n& Q4 Z* Q& J( [
4 Z/ u; F, O3 K$ F( v
不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了
作者:
pengxuleo
时间:
2013-1-24 09:52
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gengtongyu521
的帖子
5 F) @9 V q. a$ w- t7 z! B+ k' I: E
- ]( s4 ]" J7 j
不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了
作者:
pengxuleo
时间:
2013-1-24 09:53
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gengtongyu521
的帖子
@0 E+ @5 C" c7 ]$ _
3 |( e C' V0 Y3 A
不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了
作者:
easternliu
时间:
2013-1-24 12:33
上面的人吹牛，我之前有遇到，细胞都跑到分离液当中了，所以吸了很多分离液，当时头脑发热没混匀，所以离心出现你说的现象，细胞没下来。所以吸了分离液一定要混匀，尽量不要吸太多分离液，如果没办法太多了，可以适当增加离心转速。关键是要混匀。。。
作者:
sunny.yc
时间:
2013-1-24 15:06
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gengtongyu521
的帖子
' }6 G) a# p$ Z7 l$ u' A& L4 K
4 s+ J2 T( y; k. e& X! B% F6 }2 x
多吸一些没关系，只要别吸太多淋巴细胞分离液当中的”杂质“和下面的其他细胞就行了，然后用DPBS或1640混匀一下细胞，完全没有问题，我一直都是这么做的
作者:
pengxuleo
时间:
2013-1-25 14:03
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easternliu
的帖子
J+ {6 X! z& Z8 p$ x3 k
7 \: E* N+ I# b2 x/ Z } e- D6 z
你说我吹牛也得好好看看内容啊，混不混匀是实验常识问题，没人会专门提出来
作者:
easternliu
时间:
2013-1-25 16:49
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pengxuleo
的帖子
7 u/ l% q' ]% O J# @3 n' l
% g+ F- `3 q3 U
sorry，不是针对你，我是指“不会的”这三个字，操作问题也是问题，说不定就是楼主遇到的问题哈。对于新手而言，谈常识有点过了。
作者:
easternliu
时间:
2013-1-25 16:51
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pengxuleo
的帖子
- z1 C3 P; h T- u; N6 q2 [
( R! C3 S' k2 E6 y6 @
大侠顺便帮我解决个问题吧
http://www.stemcell8.cn/thread-64671-1-1.html
作者:
pengxuleo
时间:
2013-1-26 10:28
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easternliu
的帖子
# Z' s3 q. A' |( ~
4 h8 T* d; Z) w: e; w
好吧，那我以后回答的时候，写详细点。以后多交流啊
作者:
天天天雨雨
时间:
2013-2-18 15:18
若觉得有影响，可以先只吸取明显的白膜层放入一个离心管中，然后下层若有较浑浊有细胞可以单独放入另一个离心管中一起离心，
. b" ^! [ o! g( u& n: x5 Z
我们这样做过，有时候下层的淋巴层有不少细胞，有时候很少便弃掉
作者:
cheeray
时间:
2013-2-22 14:43
扩大洗涤液体洗涤。。。你可以多用几只离心管。 这样可以多收集细胞。。。
作者:
ljl1988115
时间:
2013-2-25 08:49
这种情况可以适当增加一下离心机的转速
作者:
spring1221
时间:
2013-4-19 09:13
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gengtongyu521
的帖子
* u. ~* y9 o3 q+ K2 a& H
b: g: w5 G0 S3 D+ x. M q5 D
除了用PBS洗，用盐水或者1640洗可以吗？
作者:
wwxx66
时间:
2013-4-20 17:15
不充分混匀肯定离心效果不好，吸白膜层时尽可能将白膜层洗干净，将白膜层吸出后加入到生理盐水或PBS中，离心前上下翻转一下离心管使其充分混匀，然后2000转，8-10min就可以避免细胞的丢失！
0 J$ n4 I- V% |6 x% J! \. L" {7 @. w
你可以将上清液再次倒入新的离心管中再次离心看一下，我就尝试过，混匀充分后，不存在细胞的浪费！
作者:
joe_binyang
时间:
2013-4-26 16:35
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gengtongyu521
的帖子
# t8 N, r' d. K& [- l
9 p$ z/ c$ v8 q* i. T9 A
充分混匀稀释液是必须的，分离液是水性的，只要混合充分，一定能溶解扩散，不影响效果
作者:
cheeray
时间:
2013-5-7 11:03
如果你怕收集不全。可以收集时多加几个管。
作者:
weijunning
时间:
2013-5-8 15:20
本人建议只要把白膜层吸干净就行了，没必要再吸一些分离液进去。如果用于CIK培养，2X107的PBMC就行，完全能将细胞养到109. 因为分离液也是对细胞有毒性的，如果清洗不干净，反而影响细胞生长。
作者:
wenwen1228
时间:
2013-5-28 22:47
不会有影响，加PBS混匀稀释后分离液的浓度很低了，不会使细胞悬浮离不下来的。
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