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标题: 分离PBMC时的疑问？ [打印本页]

作者: gengtongyu521 时间: 2013-1-23 10:42 标题: 分离PBMC时的疑问？

分离PBMC时，有时会多吸取一些下方的分离液，以免细胞的浪费，这样，再离心时会不会不容易使单个核细胞离心下来，而悬浮在液体中呢？

作者: Jonathan 时间: 2013-1-23 11:31

不会。因为洗的时候用的是PBS，两个应该是可以互溶的。。$ \5 n4 v, D5 q

作者: HHvivian 时间: 2013-1-23 11:43

如果有这种顾虑，PBS加多点。我也做过PBMC的分离，但未出现过单个核细胞离心不下来的情况。PBMC的分离还是比较容易的。

作者: defu 时间: 2013-1-23 15:40

操作基本过程如下：

1、抗凝血约8ml，2h内收集，混匀充分；
! v. R* C0 k% Y1 r1 t/ }) j
2、复温淋巴细胞分离液及1640；（室温自然复温2h或水浴锅中1-5min）

3、2支15ml离心管中各加入4ml淋巴细胞分离液，离心2min离下管壁上液体；

4、将8ml血吸至50ml离心管中，加入约8ml1640，混匀；

5、使用BD产3ml一次性无菌塑料吸管，将混匀后的血慢慢加到淋巴细胞分离液上；
' f7 P$ M/ K+ {5 h! G+ N4 p" p
6、1600rpm（440g/min），30min离心；

7、吸取上层血浆，用玻璃吸管吸取PBMC层至一新15ml离心管，加入1640至14ml，混匀；" a" C* x. r* R6 T% ]+ d7 R; e# l
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8、1300rpm（290g/min），10min离心；
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9、同样方法再次洗涤。
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作者: pengxuleo 时间: 2013-1-24 09:52

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不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

作者: pengxuleo 时间: 2013-1-24 09:52

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不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

作者: pengxuleo 时间: 2013-1-24 09:53

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不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

作者: easternliu 时间: 2013-1-24 12:33

上面的人吹牛，我之前有遇到，细胞都跑到分离液当中了，所以吸了很多分离液，当时头脑发热没混匀，所以离心出现你说的现象，细胞没下来。所以吸了分离液一定要混匀，尽量不要吸太多分离液，如果没办法太多了，可以适当增加离心转速。关键是要混匀。。。

作者: sunny.yc 时间: 2013-1-24 15:06

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多吸一些没关系，只要别吸太多淋巴细胞分离液当中的”杂质“和下面的其他细胞就行了，然后用DPBS或1640混匀一下细胞，完全没有问题，我一直都是这么做的

作者: pengxuleo 时间: 2013-1-25 14:03

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你说我吹牛也得好好看看内容啊，混不混匀是实验常识问题，没人会专门提出来

作者: easternliu 时间: 2013-1-25 16:49

回复 pengxuleo 的帖子) D8 f4 R, K q
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sorry，不是针对你，我是指“不会的”这三个字，操作问题也是问题，说不定就是楼主遇到的问题哈。对于新手而言，谈常识有点过了。

作者: easternliu 时间: 2013-1-25 16:51

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大侠顺便帮我解决个问题吧http://www.stemcell8.cn/thread-64671-1-1.html

作者: pengxuleo 时间: 2013-1-26 10:28

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好吧，那我以后回答的时候，写详细点。以后多交流啊

作者: 天天天雨雨 时间: 2013-2-18 15:18

若觉得有影响，可以先只吸取明显的白膜层放入一个离心管中，然后下层若有较浑浊有细胞可以单独放入另一个离心管中一起离心，; a/ f2 G. u6 X4 C4 O
我们这样做过，有时候下层的淋巴层有不少细胞，有时候很少便弃掉

作者: cheeray 时间: 2013-2-22 14:43

扩大洗涤液体洗涤。。。你可以多用几只离心管。这样可以多收集细胞。。。

作者: ljl1988115 时间: 2013-2-25 08:49

这种情况可以适当增加一下离心机的转速

作者: spring1221 时间: 2013-4-19 09:13

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除了用PBS洗，用盐水或者1640洗可以吗？

作者: wwxx66 时间: 2013-4-20 17:15

不充分混匀肯定离心效果不好，吸白膜层时尽可能将白膜层洗干净，将白膜层吸出后加入到生理盐水或PBS中，离心前上下翻转一下离心管使其充分混匀，然后2000转，8-10min就可以避免细胞的丢失！* H( }+ s0 E4 I. ?2 |
你可以将上清液再次倒入新的离心管中再次离心看一下，我就尝试过，混匀充分后，不存在细胞的浪费！

作者: joe_binyang 时间: 2013-4-26 16:35

回复 gengtongyu521 的帖子% a, @2 D$ O& E% D# @7 t9 m' Q
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充分混匀稀释液是必须的，分离液是水性的，只要混合充分，一定能溶解扩散，不影响效果

作者: cheeray 时间: 2013-5-7 11:03

如果你怕收集不全。可以收集时多加几个管。

作者: weijunning 时间: 2013-5-8 15:20

本人建议只要把白膜层吸干净就行了，没必要再吸一些分离液进去。如果用于CIK培养，2X107的PBMC就行，完全能将细胞养到109. 因为分离液也是对细胞有毒性的，如果清洗不干净，反而影响细胞生长。

作者: wenwen1228 时间: 2013-5-28 22:47

不会有影响，加PBS混匀稀释后分离液的浓度很低了，不会使细胞悬浮离不下来的。

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