分离PBMC时的疑问？

gengtongyu521

分离PBMC时，有时会多吸取一些下方的分离液，以免细胞的浪费，这样，再离心时会不会不容易使单个核细胞离心下来，而悬浮在液体中呢？

Jonathan

不会。因为洗的时候用的是PBS，两个应该是可以互溶的。。
4 |8 I: v0 Y9 m' O  S' d9 U

HHvivian

如果有这种顾虑，PBS加多点。我也做过PBMC的分离，但未出现过单个核细胞离心不下来的情况。PBMC的分离还是比较容易的。

defu

操作基本过程如下：
  \7 T$ i+ o$ c$ }3 {" r: g3 m$ y% K* i
1、抗凝血约8ml，2h内收集，混匀充分；$ F# Y# B. |4 m4 Q! j* ~" r
1 }) @* U% |4 |
2、复温淋巴细胞分离液及1640；（室温自然复温2h或水浴锅中1-5min）( l3 Q$ T' }0 K% o$ R
4 k7 U0 `8 U6 N5 T; B% Z# p
3、2支15ml离心管中各加入4ml淋巴细胞分离液，离心2min离下管壁上液体；
3 o! X. @! K) _4 }8 O  i8 k( e8 f5 b) C9 O5 [
4、将8ml血吸至50ml离心管中，加入约8ml1640，混匀；
6 q# p7 s( N4 ^& B& c; g' S
2 f2 l: G. b- s4 a8 Q5、使用BD产3ml一次性无菌塑料吸管，将混匀后的血慢慢加到淋巴细胞分离液上；/ D. D' K: s) C4 {# d

5 e7 U  v" U$ W# L6、1600rpm（440g/min），30min离心；) U) A: v& z0 o* z8 m
: t3 c8 v. `6 s+ [* N
7、吸取上层血浆，用玻璃吸管吸取PBMC层至一新15ml离心管，加入1640至14ml，混匀；7 i( S4 X' q9 y* A6 f* ]
% {, T" ?5 Q8 W" e- ~! p
8、1300rpm（290g/min），10min离心；3 f4 `  v8 w0 Y. T; h

5 E! i! @  O' I% @# m9、同样方法再次洗涤。
5 Y/ z+ w- e, Q5 |% v0 Q+ Q
7 N- f& r" \7 B  z2 j# J( \

pengxuleo

回复 gengtongyu521 的帖子' x/ V0 u1 J" j- Z2 L2 a8 y# s) s

; i5 D, ]' p4 B6 j+ \8 p不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

pengxuleo

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# k) ^' q! [+ y8 m  A% D8 Y& U9 Z5 q, Q1 Q$ D( U4 h
不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

pengxuleo

回复 gengtongyu521 的帖子. D/ W- ]5 H: S% U+ M  o4 G7 N7 b

7 W" E4 ^( t: ^( Q( i4 K7 z不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

easternliu

上面的人吹牛，我之前有遇到，细胞都跑到分离液当中了，所以吸了很多分离液，当时头脑发热没混匀，所以离心出现你说的现象，细胞没下来。所以吸了分离液一定要混匀，尽量不要吸太多分离液，如果没办法太多了，可以适当增加离心转速。关键是要混匀。。。

sunny.yc

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; A) Y. t+ y6 T, t, i1 s
0 c/ l, a6 K& _多吸一些没关系，只要别吸太多淋巴细胞分离液当中的”杂质“和下面的其他细胞就行了，然后用DPBS或1640混匀一下细胞，完全没有问题，我一直都是这么做的

pengxuleo

回复 easternliu 的帖子4 \/ S8 [9 K  E- s0 E
8 u) Y9 Q; r# l9 L# H1 t7 y' w# x, j
你说我吹牛也得好好看看内容啊，混不混匀是实验常识问题，没人会专门提出来