分离PBMC时的疑问？

gengtongyu521

分离PBMC时，有时会多吸取一些下方的分离液，以免细胞的浪费，这样，再离心时会不会不容易使单个核细胞离心下来，而悬浮在液体中呢？

Jonathan

不会。因为洗的时候用的是PBS，两个应该是可以互溶的。。
. p. S1 T0 p6 u$ _' A& g

HHvivian

如果有这种顾虑，PBS加多点。我也做过PBMC的分离，但未出现过单个核细胞离心不下来的情况。PBMC的分离还是比较容易的。

defu

操作基本过程如下：
( w3 @2 j* V. L# a. H) _+ W3 ~8 m( k" Y6 H+ Z! A+ H5 T* S# Z
1、抗凝血约8ml，2h内收集，混匀充分；  ]7 a  W6 ?" {* w. v; B3 ~

% h- D* z3 x8 p, R3 V* x2、复温淋巴细胞分离液及1640；（室温自然复温2h或水浴锅中1-5min）
% X; X6 J: l( L7 L
& @, E5 T/ _5 b2 e3、2支15ml离心管中各加入4ml淋巴细胞分离液，离心2min离下管壁上液体；
' J$ s% G; J8 c8 a9 \
( ?# i3 k; N3 i6 K4、将8ml血吸至50ml离心管中，加入约8ml1640，混匀；3 ]. e& Q; a" A  g, S
) V/ p4 |6 i: E
5、使用BD产3ml一次性无菌塑料吸管，将混匀后的血慢慢加到淋巴细胞分离液上；
3 z2 t) G! T$ b5 L& ~4 A1 ?' |5 D- {
  D0 @) x. f4 d& @( G  \6、1600rpm（440g/min），30min离心；8 s2 ^" r0 X" ?" k

6 I- Q/ T7 T  o, M' k3 `7、吸取上层血浆，用玻璃吸管吸取PBMC层至一新15ml离心管，加入1640至14ml，混匀；* |/ @& `5 k# \  e: K

6 l& O; f2 j, ]2 Y" v2 {8、1300rpm（290g/min），10min离心；
" |& N, V, j& _! ]4 X
) q1 L% v/ P7 s' E+ z9、同样方法再次洗涤。
: C) H4 f& I9 O8 R$ Q9 N) t$ J3 I2 E3 m4 _4 @4 |& I

pengxuleo

回复 gengtongyu521 的帖子& e# v, x4 ~& N

) B$ s5 F5 i$ N  v不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

pengxuleo

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  U; b0 [4 Y9 H9 z- @1 E. T6 C4 G+ p( [6 N0 T
不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

pengxuleo

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* x8 p9 C/ R. |! y  r& e, ^+ h$ a9 P
: \) e7 J$ C* e' Q; x% p; b不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

easternliu

上面的人吹牛，我之前有遇到，细胞都跑到分离液当中了，所以吸了很多分离液，当时头脑发热没混匀，所以离心出现你说的现象，细胞没下来。所以吸了分离液一定要混匀，尽量不要吸太多分离液，如果没办法太多了，可以适当增加离心转速。关键是要混匀。。。

sunny.yc

回复 gengtongyu521 的帖子3 G' T3 S- c; p* |: w  G4 f' j( H2 }

) G  S3 L7 V8 _0 ^多吸一些没关系，只要别吸太多淋巴细胞分离液当中的”杂质“和下面的其他细胞就行了，然后用DPBS或1640混匀一下细胞，完全没有问题，我一直都是这么做的

pengxuleo

回复 easternliu 的帖子8 \- d0 o9 t5 R; ^; F, d! [/ i
& }% V$ T) Z# E' u
你说我吹牛也得好好看看内容啊，混不混匀是实验常识问题，没人会专门提出来