分离PBMC时的疑问？

gengtongyu521

分离PBMC时，有时会多吸取一些下方的分离液，以免细胞的浪费，这样，再离心时会不会不容易使单个核细胞离心下来，而悬浮在液体中呢？

Jonathan

不会。因为洗的时候用的是PBS，两个应该是可以互溶的。。( f; g3 u& Y2 S; y6 B: `

HHvivian

如果有这种顾虑，PBS加多点。我也做过PBMC的分离，但未出现过单个核细胞离心不下来的情况。PBMC的分离还是比较容易的。

defu

操作基本过程如下：. E6 G4 |& w- R

7 [; [. j. U" m) `1 g) f4 f1、抗凝血约8ml，2h内收集，混匀充分；
0 e2 P& S+ U; u5 j
) P. X* M& P" d' o& v0 c2、复温淋巴细胞分离液及1640；（室温自然复温2h或水浴锅中1-5min）
: Y- D' K+ ~! S3 `- N! E$ n! B* B7 y: y; ^/ U: J- B
3、2支15ml离心管中各加入4ml淋巴细胞分离液，离心2min离下管壁上液体；
) ^1 ]4 e0 o. d" z! c
5 H. Q- P# D0 w4、将8ml血吸至50ml离心管中，加入约8ml1640，混匀；
, E& {2 p/ z( B9 Z% w0 D& K3 q9 e$ H) Q8 ?, [
5、使用BD产3ml一次性无菌塑料吸管，将混匀后的血慢慢加到淋巴细胞分离液上；2 F7 _& Q1 u) R

3 w# v, }+ C6 ^6 w) U" O6、1600rpm（440g/min），30min离心；6 w4 t! _( P" G; n7 `' B9 v: q3 ~
* m9 X' r% ?3 b8 J
7、吸取上层血浆，用玻璃吸管吸取PBMC层至一新15ml离心管，加入1640至14ml，混匀；* [9 ^" M- j6 @& U  U- t
- U& ]! j1 [, F" B
8、1300rpm（290g/min），10min离心；3 f7 W  O: Z& ^2 B

8 ?$ d! _" T. i9、同样方法再次洗涤。) ?) H0 ~/ u5 F5 Z8 y4 P
) [. k3 d! a  J

pengxuleo

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" c4 J1 _, P$ i- O+ V6 ~1 g! ]3 t' l( f, ^9 |
不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

pengxuleo

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不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

pengxuleo

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( i7 ?+ C2 \4 o1 p$ I7 p不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

easternliu

上面的人吹牛，我之前有遇到，细胞都跑到分离液当中了，所以吸了很多分离液，当时头脑发热没混匀，所以离心出现你说的现象，细胞没下来。所以吸了分离液一定要混匀，尽量不要吸太多分离液，如果没办法太多了，可以适当增加离心转速。关键是要混匀。。。

sunny.yc

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- U  Z3 x8 B6 O4 C/ \+ [( i6 J4 v6 N7 R, ?
多吸一些没关系，只要别吸太多淋巴细胞分离液当中的”杂质“和下面的其他细胞就行了，然后用DPBS或1640混匀一下细胞，完全没有问题，我一直都是这么做的

pengxuleo

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- V4 v" ?+ ^% c. n$ Z! N1 {7 e* E! v7 |
你说我吹牛也得好好看看内容啊，混不混匀是实验常识问题，没人会专门提出来