脐带组织块贴壁法求助

湖南干细胞

* R$ _0 p; ~3 X  @, Q5 P2 Q# q
4 C+ h, q; N5 ]1 w: }' p3 [
将脐带表面迅速用生理盐水冲洗三遍，冲洗干净表面血液。( N2 n3 F; B: c7 j* ^' o
剪成2-4cm小段，放在生理盐水里，撕开或剪开动脉附近脐带，抽离2条整根动脉，剪开静脉，撕掉静脉壁；将华氏胶撕出来，小剪刀剪碎，再用眼科剪剪成0.5-2mm3。4 P  P; |$ U9 X
4、贴壁：用15%FBS的培养基将T25培养瓶湿润一下，用注射器针头挑取小组织块从瓶底向瓶口铺好；
4 K5 q8 h7 Y+ @* @. A5、添培养液：4h后用巴士管吸取培养液，小心滴到组织块上及组织块周围，以刚刚能没了组织块为宜。
; u7 Q! g& u) l6 a* A以上是我的组织块贴壁法，请教：
8 m* ~  b4 a7 z4 v  u; y①组织块很难剪成1mm3，剪了大半个小时还是有2mm3左右大小，怎么办？; L. c9 b% a/ y) a0 P% J* ?- ~
②组织块贴壁时，组织块之间应该留有一定间隙还是聚集在一块儿?4 H% D, |6 A3 a9 r4 {4 \  h9 ]
③抽离动脉后，发现胶的颜色有点发黄，有没有找错胶。或者是剥离血管时间花了太久，用了将近3个小时。
' n( x( C4 N) U3 s+ g! @剪碎后要不要PBS洗涤，还是直接贴壁好？) t( l- O8 M9 F
用碧云天的多聚赖氨酸铺瓶后立即PBS洗涤2遍，这样会不会影响贴壁效果？还是要铺5min,
, W8 k" S; o1 S' _0 h* c6 y; F以上方案，第二次剥脐带，有什么不妥，请各位指教。

chslyx

回复 老姜 的帖子# f; \) R  U4 b3 l1 J

: d2 D$ i4 B. P. X+ C请问一下是不是只去掉了动静脉就可以了？脐带表皮要去掉吗？

pcljsw2008

提提我的看法，第一，组织块太大了，而且密度太高，应该让组织块均匀分布在里面，互相不粘连，第二，楼主剥胶时间太长了，一般我操作只需要十五分钟，之后就是剪了，第三，组织块剪碎之后不用离心，要是脏的话离心一遍足够了，用生理盐水，不用用dpbs

yaoting111

接的太密了，让组织块均匀分布

weijunning

回复 湖南干细胞 的帖子0 k0 |  p" D5 X9 i& C" C

, P9 k$ @  v  X- W8 }; e* Q污染了

weijunning

回复 湖南干细胞 的帖子! a" X8 I$ \6 d3 Y- J6 ^

7 n) j( ^$ u- h# A- v4 x( q& U你这样铺组织太密了，但是应该不会影响细胞爬出，大概在5天左右。下次组织块之间间隔大约0.5cm，留有空隙可以更有利于细胞爬出。

2013sp

回复 老姜 的帖子
, G/ G/ c! S$ }, ^7 I# ]
& `$ i# j: a, L, V/ `6 h前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。
3 R4 S8 m6 g, u/ k1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。
' p+ |: w9 N% z9 n# e2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。        # k0 C0 B  [. b6 g
3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。+ K$ F1 x/ q7 s
4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。
0 m6 [4 @- d" P/ U5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。( O7 B' `. U- r0 X& w, a
6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。: |2 B7 u1 `1 B& z
7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。' L+ }! Z& j7 f# {
8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）
6 ^/ V: I1 H9 z3 W; P) q! ]: T* a9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。
- b: |% O" w+ u8 H( R10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。

2013sp

回复 单个核细胞 的帖子5 D) W9 I9 X* J3 x

2 s* L0 {  w3 l1 s前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。* x5 [5 }1 Z" w- ~; a
1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。
/ a* r/ |/ u; ~  J. b5 M5 O2 d2 w2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。       
; B& m% w9 G, H+ y2 ?* `* {3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。
' r/ D* |" d9 n3 Z4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。" C2 S7 ~9 S9 e) F
5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。2 I( l  F$ V, z- n! e
6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。
+ m1 h" K9 X2 _7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。
: y( e! f8 j" |+ r4 _/ h3 k8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）' A. {1 F! R6 y- w- ^4 G2 V) D2 T
9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。; @& l" ^. H) b) _, H. g- e
10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。

2013sp

回复 湖南干细胞 的帖子# E+ X) N9 }; p, r* G

) [! L# M- t- V6 J7 ~2 f" r( x前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。7 X, }/ Y0 y4 @
1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。: W/ C- Q3 z3 U) L
2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。       
" M( D6 b9 ~5 y# \3 x0 Y5 [) Y4 B3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。, \8 i; i4 I2 Y3 S  Y
4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。
: g# u( V  W1 K; s0 ^, q5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。
; `# w6 |, C! B$ u- l8 P  D6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。
( a6 Q; f+ J6 K+ ^& @7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。
2 \! l7 Y- z' n2 V; A7 c8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）
2 R' C8 w( m0 T  K/ v- K9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。; r. Z3 n9 u+ c5 B% U7 G
10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。

2013sp

回复 单个核细胞 的帖子" H* b8 r9 v5 B9 @6 a* a
, Y& @9 f2 X" r/ |9 |
前辈，您好，我分离培养间充质干细胞时每次都只获得较少细胞，主要是用培养瓶培养时，组织块漂浮过多，一般仅剩3~4块；用培养皿培养时组织块漂浮较少，但是有细胞爬出的组织块极少。多次都是这样，一直未找到原因，请前辈帮忙分析一下原因，不胜感激。以下是我的操作方法。
7 D4 T4 u) s6 N7 P. W+ _8 p1.        取新鲜脐带，放入生理盐水中尽快带回实验室。9 b/ `9 z( W9 ^; N
2.        使用医用镊子将脐带从脐带采集瓶中轻轻取出，用PBS冲洗掉脐带表面的血液，然后置于盛有75%酒精的烧杯中浸泡5min，再用PBS冲去脐带外周血块，将其清理干净。       
8 v, q( B* F" w8 k$ L3.        用双抗生理盐水（双抗PBS）对剩余组织在余下的两个烧杯中进行充分清洗，一般冲洗两遍，去除血污。
+ }* u* {8 H5 n" @7 R- U4.        将洗净的脐带置于另一大号的培养皿中，均分为4~5部分，平均每部分约长2~3cm。
' L6 e  y! B" L& F5.        纵向稍剪开外表皮，再用带齿镊子沿着剪的方向把外表皮撕开，在进行两动脉和一静脉的剥离，该过程基本全用镊子操作。
/ X5 m. s5 ?) s$ i0 D7 {6 M# l6.        整个过程可在含0.1%双抗的PBS中进行，以确保无菌操作。+ M3 b! u" X4 }3 ^3 [% O" p- z* o7 O
7.        去除脐动脉与脐静脉后，用生理盐水进行多次冲洗，确定洗去残留的血块。
9 ^3 L" O: h  N% K5 M8.        将获得的华通氏胶剪成1~3mm3的小块（将华通氏胶转移入青霉素瓶中，使用弯剪将其剪碎，大约剪10min左右）3 t; ]/ v0 i7 M* Y
9.        使用吸管将组织块逐一种植入包被好的T75培养瓶中，密度20~25块/瓶为宜，间距0.5cm）。向培养瓶中加入少量培养液，以保持组织块湿润为好，然后正向置于37℃体积分数为5%CO2饱和温度湿度温箱中约4~24h,使组织块紧贴于培养瓶底壁。' B; z, B# L9 C* r
10.        待组织块贴壁后向培养瓶中沿瓶壁缓慢注入含15%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养液,刚刚浸入组织块（T25培养瓶加5ml 液体，T75培养瓶加9ml培养基）。
% c0 d( ^7 `5 n11.        4~5天后进行全量换液，以后每三天按相同方法换液一次