mips的传代问题

zhangtcm

          一、mips传代过程中有没有必要去除MEF？我们从许多文献中看到了这么个词，差速贴壁，即依靠细胞不同的贴壁速率，去除某些细胞，如MEF细胞一般会在45min到1小时内贴壁，即可去除MEF。但我们认为即使传代操作，下一代还是需要MEF的，那么传至下一代，即使让老的MEF贴到下一代的培养瓶中，总不至于老的MEF贴上去，把新的MEF挤走了吧，所以不特意去除，又有何妨？  r' D6 H! }) V/ v. x$ ?, `# g

7 `" ^6 m: u: n# d( ]# I* ~
: H9 Q$ `6 w9 s, h4 \; \        二、 今天又在丁香园上看到这么一段话："饲养层细胞是ＭＭＣ处理过的，已经丧失了增殖分裂能力，传代时可以不管．传代后次日换液，就可以把未贴壁的细胞（大部分是饲养细胞，还有一些已经分化的ＥＳ细胞）去掉"，如果饲养层细胞是不会贴壁的，那差速贴壁去除饲养层细胞，更不是成了一个笑话。5 q' ?9 g2 ~7 a! O5 v& k2 o
本人现在决定，培养一段时间MEF（不加mips），再消化后，使用差速贴壁法，看看细胞究竟是能不能在1小时内贴壁。或者在第二天换液时仍然未贴壁。
& z0 X5 ^6 O: K
- b! G- u. L/ ^# ~4 v% e8 u, V! c# P5 ~
      三、传代操作时最头疼的是怎样去除分化的细胞问题，在无饲养层细胞的情况下，依靠分化的细胞要比未分化的细胞贴的快，是不是能用差速贴壁的去除一部分分化的细胞，那么这个时间又怎么定?  我们尝试了1个小时的差速贴壁，去除未贴壁的细胞后，把贴壁的细胞再吹找起来，再送入有饲养层细胞的培养瓶中，这些细胞并未能长成成纤维细胞状。仍是圆形的。$ |5 s# a5 x5 f0 \

' |+ L: q3 V8 t上述三点是个人愚见，请各位指教。8 \, H& q% L$ h) u% s9 e

Yedan

1和2一起回答吧（问题差不多）：现在on feeder上的mES传代，基本都不需要贴feeder，即使你的ES是要去做EB或者别的什么实验（比如收RNA，直接连feeder一块儿用Trizol裂掉都行），老的feeder自己就飘了，第二天换液就没了，如果是48h换液的体系，传代后第二天看一下，飘的多换下液，如果不多就没必要了。至于贴feeder，确实是利用MEF和ES贴在gelatin板上速度不同，但是不代表说45min的时间里只有MEF贴而ES完全不贴，我不知道LZ你贴完之后看不看细胞的，你仔细观察，贴壁的细胞有大有小，大的是MEF小的是ES，但是飘着的细胞里也还是有大的MEF的，只是比例不同，贴的大部分是MEF罢了。
# t7 a0 O8 S2 Y6 F' s& g9 Nfeeder free culture，最头疼的问题是分化细胞去不掉，但是靠贴是去不掉的，只有通过挑克隆的方法去除（把分化的去掉或者把好的挑出来都可以），为什么贴feeder的方法不行，mES培养过程中分化的细胞只是失去了morphology的特点，严格地说是mixed状态的细胞，再差点也只是刚分化，Oct4肯定都还是阳性的（当然我说的是每次传代的时候出现的分化细胞啊，不是什么几天不管的细胞），这个离MEF还远了点。

zhangtcm

回复 Yedan 的帖子
6 q' a: D+ I5 j2 z& {6 D( m5 {
1 P$ Q0 N* c0 a3 K$ D- ^, ?+ L) x非常感谢你的解惑