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回复 shagu 的帖子9 H! W5 P9 x* r% g' t
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请参考下我看到的这篇，转载给你，看能否有些帮助。- k8 D7 e. r! c& b
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流式细胞周期检测
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1 b4 S' }: e0 d3 g- _流式细胞周期结果图解读(附图详解)Time：2010-12-07 PM 19:03 Author:bioer Hits: 51 times 3 v5 |+ T( B+ {9 ?6 U
流式检测细胞周期操作步骤
0 ^ a5 {1 h: }& C5 r& I1. 细胞培养：( ] T4 n. a$ k) f1 G# K; ]! f
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取对数生长期的细胞，按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，进行下一步的实验。! L3 O6 i" ~6 z( k4 t
2. 细胞固定：
4 n! W. Y. ]; C: D 800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。6 D9 ~7 {: n- w. K
3. 细胞染色：
+ R" M# G- d' P* Q4 a. K- @ T# R( ~ y) B7 B* v3 S
1500rpm离心5min，弃上清，以3mL的PBS洗涤一次，加入400uL溴化乙锭（PI，50ug/mL），100ul RNase A（100ug/mL ），4℃避光孵育30min。/ `( ^ x8 B" j
$ `( ]( {0 D, I& Z% O/ o4. 流式分析：
& P* m/ S' ]+ r, y# i5 C& u 以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2~3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。
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+ Q r L! O# \1 F6 z注：上机前要以50um尼龙网膜或35um细胞过滤器过滤细胞！因为PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团！7 M( m, ~9 o7 q, \. G' ~
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流式细胞周期结果图解读
' x6 O! @; U! Z6 y* v首先来认识一下流式细胞周期结果图：
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6 b. s2 v! W3 \/ e$ ~- ~$ f5 R
1、纵坐标Cell Number：即计数的有效细胞数；
n- L! U) k0 V, ` 2、横坐标DNA Content：即DNA含量；5 b. ]8 `1 v0 x6 A/ V7 C" w
3、G1、G2、S三期在图中已经标示；
! n) M. e$ t$ k" v7 Q% C) [7 N 4、右侧数字含义：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA含量平均值为55.56；53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA含量平均值为107.72，5.64%即G2期细胞数占总数的5.64%；以此类推… 8 Y# u$ v5 J1 I, D* ^. L/ y
流式细胞周期结果图的意义，主要从细胞周期的角度看各参数的意义：% v& v W/ o% ` S$ D# Q8 w7 Q
1、细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。
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可分为四个阶段：. w8 f' j1 c. T6 I& B# v& P
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h* ^9 @5 G/ Q, S n8 ] ① G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；: ~3 |) m2 k% [( w
② S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；
! y2 f2 L+ v0 c4 W0 O ③ G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；4 c) k, h9 T/ Z3 y+ W3 B
④ M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。- j' P' |: k$ B
2、从增殖的角度来看，可将高等动物的细胞分为三类：
9 J' [+ F% t8 c9 }. P. |$ _ ①连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞，如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞。
0 H8 v0 c+ Q+ z) W; T% \ ②休眠细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞，如淋巴细胞、肝、肾细胞等。
8 c* H/ x4 U* \8 Z6 a" I ③不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞等等。' @* d3 |1 x& S# A
细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关，如：小鼠十二指肠上皮细胞的周期为10小时，人类胃上皮细胞24小时，骨髓细胞18小时，培养的人成纤维细胞18小时，CHO细胞14小时，HeLa细胞21小时。不同类型细胞的G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。
; S D1 T3 D6 {8 d3 I: S+ X3 R3、流式细胞结果图各参数的意义：8 K. ]( [8 ~* k- a- L! ?! m
* G' \+ q; V$ P. H6 D5 }
; r/ C# b' a+ \& e 常用的流式细胞术分析细胞周期的方法是依据细胞DNA含量（横坐标）来分析的：
* _0 b: ], \2 k2 G6 ]3 V G1期：DNA复制还没开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰；" }8 v4 a/ u. s% ?) m/ e
S期：DNA开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）；8 C( P- t7 n; y! J+ d/ {4 }
G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第三个峰；
3 S8 t- s. @$ I3 E7 c; N) o M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开，所以有第三峰明显升高时报告：G2/M期阻滞。$ P/ ~0 `0 ~- y# h/ ^0 m
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发表于 2013-3-12 10:18
发表于 2013-3-12 16:03
