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回复 shagu 的帖子4 q8 t5 m& A3 E( G4 q
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请参考下我看到的这篇，转载给你，看能否有些帮助。4 U. y: S# ~9 [
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流式细胞周期检测) h6 c8 }0 J# k% C7 P
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流式细胞周期结果图解读(附图详解)Time：2010-12-07 PM 19:03 Author:bioer Hits: 51 times 7 U8 Q+ ~$ M" ~& y7 k; P# v
流式检测细胞周期操作步骤2 B2 d7 i5 i& Q5 r+ F5 }
1. 细胞培养：: |( {( P1 ~; y5 L1 H7 |
% S3 _/ Q5 m% V3 |) h0 R 取对数生长期的细胞，按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，进行下一步的实验。
+ Q" W7 N9 g W1 D. t& i2 `# G4 i2. 细胞固定：
: b0 ~6 q. x. N) `3 E a. k9 ^ 800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。' Z# ]0 \" J" L8 y- t. }" I
3. 细胞染色：
- r2 h9 o2 m# Y% A. V4 R2 W: ^9 c1 x8 @4 {* @
1500rpm离心5min，弃上清，以3mL的PBS洗涤一次，加入400uL溴化乙锭（PI，50ug/mL），100ul RNase A（100ug/mL ），4℃避光孵育30min。
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# |6 N0 _8 M3 Y4 l' Z0 t" u- C1 K/ Z% @6 K4. 流式分析：' |' t; I. q: l3 U( a% H2 s# L
以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2~3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。5 l, `" {( f# ]7 A& y8 w( T
, e. L* h6 q. U* t: V9 n注：上机前要以50um尼龙网膜或35um细胞过滤器过滤细胞！因为PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团！
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流式细胞周期结果图解读 - {4 `/ F$ C3 g! o y5 f8 R# t& X
首先来认识一下流式细胞周期结果图：
; u6 x% ]! r- R ) n8 T+ D4 ^. @/ @9 m
1 J$ k4 f: X2 Q- g* x" f
1、纵坐标Cell Number：即计数的有效细胞数；( ?1 ? W+ z: a! _$ V5 p9 H) B
2、横坐标DNA Content：即DNA含量；
; |2 Q! [# m2 ^7 d5 O& L4 d 3、G1、G2、S三期在图中已经标示；' Y2 Y* |$ f" y, c, R8 ]
4、右侧数字含义：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA含量平均值为55.56；53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA含量平均值为107.72，5.64%即G2期细胞数占总数的5.64%；以此类推…
& h5 d# `& |5 |8 z5 Q6 i4 i; e流式细胞周期结果图的意义，主要从细胞周期的角度看各参数的意义：$ R9 E0 d& p+ N! o
1、细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。- \$ A) N: h7 r$ h9 O
: {! O, C! ?* `7 p/ G+ v
可分为四个阶段：
e' a4 A6 d+ i" h( T; | ' ~3 M6 H$ H! \
7 o& _' G5 p5 j3 E8 ?: M9 ^- R" v ① G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；
7 L( F% ~; u# D% M. `: @ ② S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；& ?5 k/ {' P* a w9 S4 s# f+ V
③ G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；
& j* J4 o- H7 t9 A( j$ V# S3 ^! | ④ M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。
9 \( h8 `' z2 h2 r3 O2、从增殖的角度来看，可将高等动物的细胞分为三类：/ I/ j5 F& i( @
①连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞，如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞。
7 Y. X: a3 @) A3 e ②休眠细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞，如淋巴细胞、肝、肾细胞等。
/ P4 i6 u* Z2 L5 P ③不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞等等。7 x. Y' d$ D% l; e
细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关，如：小鼠十二指肠上皮细胞的周期为10小时，人类胃上皮细胞24小时，骨髓细胞18小时，培养的人成纤维细胞18小时，CHO细胞14小时，HeLa细胞21小时。不同类型细胞的G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。
$ }1 g. C+ U, g& `3、流式细胞结果图各参数的意义：
) G) e2 t4 u- I" {
5 }: L' Y) z" b- }6 N% Y & U3 | B) n4 ?; \
常用的流式细胞术分析细胞周期的方法是依据细胞DNA含量（横坐标）来分析的：. p$ `- r2 J" i3 X
G1期：DNA复制还没开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰；
) @7 E7 f) \ Y+ A( D! k3 b9 I5 u7 h S期：DNA开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）；
3 }+ @4 i- j/ r- P+ C G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第三个峰；
) N/ x9 W, P# Q; | M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开，所以有第三峰明显升高时报告：G2/M期阻滞。
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发表于 2013-3-12 10:18
发表于 2013-3-12 16:03
