求助初养大鼠骨髓间充质干细胞，哪位高手指点一下如何测细胞周期啊？

shagu

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初养大鼠骨髓间充质干细胞，哪位高手指点一下如何测细胞周期啊？谢谢谢谢！

guen

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流式分析即可

yinfuhua

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: d& J! x0 Q, [3 M请参考下我看到的这篇，转载给你，看能否有些帮助。
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9 a$ W9 a) ?. r2 S5 q  t! M3 n$ @流式细胞周期检测2 Y/ n$ j6 k' _2 ^

( _3 Y) _% i- [  h% T流式细胞周期结果图解读(附图详解)Time：2010-12-07 PM 19:03　　Author:bioer　　Hits: 51 times 　
3 X0 X* I' n5 B% C# s8 C流式检测细胞周期操作步骤
& G3 F7 B: s( _/ ~4 K) @' g1. 细胞培养：
' ]5 A# \& z1 @
5 C( E5 N3 F7 ]5 y　　取对数生长期的细胞，按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，进行下一步的实验。
9 r# b$ u2 j% y; d; k; I- a8 A' X2. 细胞固定：
8 v4 ?* S) Z' C7 a2 }7 z　　800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。
1 ^# J0 G6 |1 D1 {4 g3. 细胞染色：
8 _; P9 T* [( ?
( a& G  m/ S2 E) t+ j　　1500rpm离心5min，弃上清，以3mL的PBS洗涤一次，加入400uL溴化乙锭（PI，50ug/mL），100ul RNase A（100ug/mL ），4℃避光孵育30min。
$ N; r& g0 d3 U5 y# I3 M, g+ n* r" }6 r" w2 Q2 F2 @8 G
4. 流式分析：
1 Z! k. z3 _  j3 R　　以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2~3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。
! t% h$ N% T1 `4 n. ^' U0 c; O" g1 ]
注：上机前要以50um尼龙网膜或35um细胞过滤器过滤细胞！因为PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团！( Q& u; p. `4 }

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" _, U' c! w  t流式细胞周期结果图解读　  
* F* i2 k2 e5 w  K3 Y首先来认识一下流式细胞周期结果图：
' {4 {1 d6 v7 z4 p% v
# W2 z4 C, ?* B* p; ^9 H' A( o7 V/ f7 v
　　1、纵坐标Cell Number：即计数的有效细胞数；
; f2 ]% ]) D$ J. z　　2、横坐标DNA Content：即DNA含量；
) b9 S, u6 {; L4 ~0 D　　3、G1、G2、S三期在图中已经标示；2 w  b  x9 W/ Z6 G- N
　　4、右侧数字含义：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA含量平均值为55.56；53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA含量平均值为107.72，5.64%即G2期细胞数占总数的5.64%；以此类推…   
# y2 K; j5 X* Y9 @流式细胞周期结果图的意义，主要从细胞周期的角度看各参数的意义：
8 S7 g- y+ s( C/ P& y9 g: G) E1、细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。/ ^9 w/ n* X9 r8 {  L% u8 E
9 s9 R( C4 e7 x4 o- R
　　可分为四个阶段：
( r% g9 A0 n; G% c. t' C3 @& V # Y! m! D9 O" Z  l3 \! l# U) o
　　　　　　: _% v9 X1 |. h0 R( [
　　① G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；, l/ x; m2 B1 ~; e$ O
　　② S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；
+ Z" X" _+ Q% [' b　　③ G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；) m/ V% M" ?+ y1 [# X7 e3 t1 M
　　④ M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。
1 I! F- V3 z& k! V2、从增殖的角度来看，可将高等动物的细胞分为三类：& f, j0 C; @) g4 q& B6 R* |
　　①连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞，如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞。! ^% ?) i1 p% I4 A
　　②休眠细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞，如淋巴细胞、肝、肾细胞等。& N4 C9 I; G0 b$ y6 p% v  \7 R
　　③不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞等等。
% p( s3 a; t: m: P0 e' [# G　　细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关，如：小鼠十二指肠上皮细胞的周期为10小时，人类胃上皮细胞24小时，骨髓细胞18小时，培养的人成纤维细胞18小时，CHO细胞14小时，HeLa细胞21小时。不同类型细胞的G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。
9 P2 W. G2 x# }2 s3、流式细胞结果图各参数的意义：% b$ B1 \/ e5 b8 P2 ?
  s8 [5 b# M. F& V
　　　　　. R+ o( E: L7 D2 Z8 \
　　常用的流式细胞术分析细胞周期的方法是依据细胞DNA含量（横坐标）来分析的：% x: o. ?4 P) d7 v+ h
　　G1期：DNA复制还没开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰；. F7 U0 _% i# K. c+ Z, e
　　S期：DNA开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）；
  V; w8 Y! u; F  H0 [* R　　G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第三个峰；
0 a) I7 S1 F5 ?9 H9 T7 t　　M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开，所以有第三峰明显升高时报告：G2/M期阻滞。
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shagu

嘿嘿，很好很好，非常感谢！

倒腾细胞

极好！感谢前辈 请问现在样本已经用4%的多聚甲醛固定 然后悬浮于PBS中 放四度冰箱几日  现在想接着做流式测周期 请问是离心去PBS后加乙醇再次固定吗！？