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回复 shagu 的帖子# y; t! ~* A5 G9 r' \( E( W" z' s
4 F" h& f7 U& u o
请参考下我看到的这篇，转载给你，看能否有些帮助。
/ u+ p% [2 r- g0 j9 c& J* n8 x
( k3 n; j" H0 n4 g/ N7 j# o流式细胞周期检测( u \/ ^4 |: ]6 B. |
& m; e0 u, F b3 R1 b) R! {8 H流式细胞周期结果图解读(附图详解)Time：2010-12-07 PM 19:03 Author:bioer Hits: 51 times
: v3 G! f) X/ _; K流式检测细胞周期操作步骤4 V- o, s3 |, j" A) t* F% s
1. 细胞培养：; `& m. J" G- m/ H* x1 Y, F
) l. w- j4 A% ]- p4 R2 g$ H, N
取对数生长期的细胞，按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，进行下一步的实验。
1 h r# ]: K6 c/ C8 H2. 细胞固定：
0 r8 S/ {" }8 O 800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。+ I$ ]2 V+ u- [) Y2 M0 z+ v% Y8 ]
3. 细胞染色：1 x8 S2 W2 i8 b+ _
2 x+ U% C0 @% k' L/ O) ^
1500rpm离心5min，弃上清，以3mL的PBS洗涤一次，加入400uL溴化乙锭（PI，50ug/mL），100ul RNase A（100ug/mL ），4℃避光孵育30min。' V- E) s; M, Y1 D9 v) d4 a
6 A: X3 _5 ^# Q
4. 流式分析：
. | `# n" b) d: Q 以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2~3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。
6 [: Y# @! W N* R, M
% t g$ h, F: J& p/ e! [注：上机前要以50um尼龙网膜或35um细胞过滤器过滤细胞！因为PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团！: g+ P, Z7 G) H8 U; H3 m F
) f# u1 q$ l7 s) }. N" v3 I$ w8 |1 D1 {( f# s
流式细胞周期结果图解读 0 M x! G. @! G
首先来认识一下流式细胞周期结果图：% R2 h8 h1 {1 ?# r6 e- Q
! U5 }' J# ~& U. p7 Q3 a- T/ N
+ w5 k; i# a6 B1 `$ V& W7 j* O 1、纵坐标Cell Number：即计数的有效细胞数；9 G4 h! v' I9 F0 d! E: |7 _7 w
2、横坐标DNA Content：即DNA含量；
4 V4 t4 }8 S! M; P 3、G1、G2、S三期在图中已经标示；9 o# p7 k2 |: u, n
4、右侧数字含义：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA含量平均值为55.56；53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA含量平均值为107.72，5.64%即G2期细胞数占总数的5.64%；以此类推…
. Z7 K7 }; p5 o8 |" p3 Y% v流式细胞周期结果图的意义，主要从细胞周期的角度看各参数的意义：
2 L. m. S) e" m' f: u P h1、细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。) u d+ Z% m0 t
8 G! @# x7 K& q7 s0 y& j# x 可分为四个阶段：
0 I9 |- r5 P) F* T' f5 ?- _
/ m& M* r7 k/ z " e( f, `0 {, b7 S3 d$ `0 n, a
① G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；& _, T" Q- e7 x' t/ r2 o, G
② S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；: y* P2 [+ [! ?2 j- b
③ G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；
% a. C3 S0 O" w$ q- v ④ M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。
1 k4 w$ M; M1 g9 F4 p2、从增殖的角度来看，可将高等动物的细胞分为三类：
0 R6 T! h6 f. w* L, R5 u' I0 [ ①连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞，如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞。
0 k5 y1 T @" z' N/ f0 `, o4 Y4 q" L ②休眠细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞，如淋巴细胞、肝、肾细胞等。
, t5 f. h* c) J. x$ V9 ^ ③不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞等等。
* I! }5 q& z. V t. A 细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关，如：小鼠十二指肠上皮细胞的周期为10小时，人类胃上皮细胞24小时，骨髓细胞18小时，培养的人成纤维细胞18小时，CHO细胞14小时，HeLa细胞21小时。不同类型细胞的G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。
$ P) U" v, p1 h9 T3、流式细胞结果图各参数的意义：
) [7 r" M1 d( G1 |: ~# I6 f: F6 [8 P% u1 f! o3 H- T
- _' t1 R! e' m& B* O6 d+ F6 G4 m 常用的流式细胞术分析细胞周期的方法是依据细胞DNA含量（横坐标）来分析的：7 I# G5 ]8 ?5 c3 a/ e# t6 @0 \
G1期：DNA复制还没开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰；& p$ |7 Z+ F0 E: f
S期：DNA开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）；- q o+ p( n8 D `
G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第三个峰；6 n* E) C! ^) w4 @9 @% B& y* z
M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开，所以有第三峰明显升高时报告：G2/M期阻滞。
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发表于 2013-3-12 10:18
发表于 2013-3-12 16:03
